分子生物学常用检测技术
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dCTP dGTP dTTP dATP
和 或 和
a
Taq DNA 聚合 酶
模板 引物
9
PCR的种类
• 荧光定量PCR • 通用引物PCR • 多重PCR • 巢式PCR • RT-PCR • 原位PCR • 免疫PCR • ……
a
10
荧光定量PCR
TaqMan探针
forward primer
probe
• 第二代测序技术大大降低了测序成本的同时，还
大幅提高了测序速度，并且保持了高准确性，但
在序列读长方面比起第一代测序技术则要短很多
。
a
25
五、基因重组技术
• 基因重组是指一 个基因的DNA序列 是由两个或两个 以上的亲本DNA组 合起来的。
• 基因重组是遗传 的基本现象，病 毒、原核生物和 真核生物都存在 基因重组现象。
Rn (荧光强度)
定量PCR的数学原理
Ct （Cycle threshold）值： 是指每个反应管内的荧光信 号到达设定域值（threshold） 时所经历的循环数。
平台期
指数增长期
循环数Cycle Number
CT = - k logN0 + b
a
来自百度文库
13
PCR的临床应用
对病原微生物核酸进行快速检测 弥补免疫检测的缺陷 缩短诊断的窗口期（如HBV,HIV） 用于药物疗效监测和评估 用于肿瘤基因表达方面的研究 用于遗传病的诊断
R
Q
5'
3'
3'
5'
5'
3'
5'
Q
1. Polymerisation
reverse primer
5'
3'
3'
5'
2. Strand displacement
R
Q
5'
3'
3'
5'
3. Cleavage
R = Reporter Q = Quencher
5'
R
3'
5'
5' 3'
5' 3'
4. Polymerisation completed
a
5' 3' 5'
Q
5' 3' 5'
11
定量PCR的数学原理
PCR 理 论 方 程
平台期Plateau 线性增长期Linear
N = N0 x (1+E)n
N：扩增数量 N0：起始模板数量 E：扩增效率 N：循环数
Log [DNA]
y = N0 (1+e)n
指数增长期Geometric
循环数
a
12
a
26
基因重组技术的应用
• 转基因植物
• （抗虫、抗冻、抗病、高产）
• 转基因动物
• 基因工程药物和疫苗
• 基因治疗
a
27
小结
分子生物学技术的临床应用
• 疾病的诊断
– 感染性疾病诊断
– 肿瘤性疾病诊断
– 遗传性疾病诊断 – 组织配型和器官移植
• 基因治疗
用途广泛 功能强大
• 基因工程产品
– 转基因植物
a
3
变性、复性、退火和淬火
a
4
基因
a
5
分子生物学常用技术
1. PCR（聚合酶链式反应） 2. 核酸分子杂交 3. 基因芯片技术(biochip) 4. DNA 测序（DNA sequencing ） 5. DNA重组技术(DNA recombination)
a
6
一、聚合酶链反应
（Polymerase Chain Reaction ，PCR）
a
18
三、基因芯片技术
• 基质材料分， 有尼龙膜、玻 璃片、塑料、 硅胶晶片、微 型磁珠等。
a
19
用点样法固定 在玻璃板上的DNA 探针阵列
原位合成法在玻璃等 硬质表面上直接合成 的寡核苷酸探针阵列
a
20
基因芯片技术的应用
1、药物筛选和新药开发 2、疾病诊断 3、环境保护 4、司法 5、现代农业
a
21
四、测序技术
（一）一代测序技术
a CTTGATCTTCAGGTAGGCCTGAAT22CCT
（二）二代测序技术
• Illumina公司的Solexa和Hiseq应该说是目前全球使用量最大 的第二代测序机器，这两个系列的技术核心原理是相同的。
• Illumina/Solexa Genome Analyzer测序的基本原理是边合成边 测序。
体外基因扩增技术
➢特异性强 ➢灵敏度高 ➢操作简单、省时 ➢对待检原始材料质量要求低 ➢高效率的基因扩增技术
a
7
（一）PCR原理
原理
双链DNA 变性
退火 链延伸
（膜板） （双链分成单链） （膜板与引物杂交） （DNA合成）
不断重复
a
8
（二）PCR反应的设计及影响因素
PCR反应体系
Mg2+
Mn2+
a
14
样本采集要求
a
15
a
16
二、核酸分子杂交
根据核酸变性和复性 的原理，不同来源的 变性单链核酸分子在 合适的条件下，通过 碱基互补形成双链杂 交体的过程称为核酸 分子杂交 （molecular hybridization）。
a
17
核酸分子杂交的临床应用
• 1、遗传病的诊断 • 2、病原体的鉴定 • 3、癌基因突变的检测 • 4、组织配型 • 5、亲子鉴定
• 在Sanger等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色
的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，
每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光
信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序
列信息。
a
23
a
24
技术特点比较
• 第一代测序技术的主要特点是测序读长可达 1000bp，准确性高达99.999%，但其测序成本高 ，通量低等方面的缺点，严重影响了其真正大规 模的应用。
分子生物学常用检测技术 及临床应用
a
1
a
2
DNA—四种核苷酸（A-T-C-G)组成 的多聚骨架
所有组成DNA的核苷酸 dATP,dTTP, dCTP,dGTP
都由三种成分组成： 1）一个2’-脱氧核糖（戊糖） 2）一个含氮碱基
嘌呤：A\G 嘧啶： T/C 3）三个磷酸基团
各单个核苷酸由5’和3’-碳形 成的磷酸二酯键连接在 一起
– 转基因动物
– 基因工程药物和疫苗
• 法医学方面
a
28
基因工程的危险性
a
29
基因的世界很奇妙， 期待你的关注和参与！
a
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和 或 和
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Taq DNA 聚合 酶
模板 引物
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PCR的种类
• 荧光定量PCR • 通用引物PCR • 多重PCR • 巢式PCR • RT-PCR • 原位PCR • 免疫PCR • ……
a
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荧光定量PCR
TaqMan探针
forward primer
probe
• 第二代测序技术大大降低了测序成本的同时，还
大幅提高了测序速度，并且保持了高准确性，但
在序列读长方面比起第一代测序技术则要短很多
。
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五、基因重组技术
• 基因重组是指一 个基因的DNA序列 是由两个或两个 以上的亲本DNA组 合起来的。
• 基因重组是遗传 的基本现象，病 毒、原核生物和 真核生物都存在 基因重组现象。
Rn (荧光强度)
定量PCR的数学原理
Ct （Cycle threshold）值： 是指每个反应管内的荧光信 号到达设定域值（threshold） 时所经历的循环数。
平台期
指数增长期
循环数Cycle Number
CT = - k logN0 + b
a
来自百度文库
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PCR的临床应用
对病原微生物核酸进行快速检测 弥补免疫检测的缺陷 缩短诊断的窗口期（如HBV,HIV） 用于药物疗效监测和评估 用于肿瘤基因表达方面的研究 用于遗传病的诊断
R
Q
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3'
3'
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1. Polymerisation
reverse primer
5'
3'
3'
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2. Strand displacement
R
Q
5'
3'
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3. Cleavage
R = Reporter Q = Quencher
5'
R
3'
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5' 3'
5' 3'
4. Polymerisation completed
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5' 3' 5'
Q
5' 3' 5'
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定量PCR的数学原理
PCR 理 论 方 程
平台期Plateau 线性增长期Linear
N = N0 x (1+E)n
N：扩增数量 N0：起始模板数量 E：扩增效率 N：循环数
Log [DNA]
y = N0 (1+e)n
指数增长期Geometric
循环数
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基因重组技术的应用
• 转基因植物
• （抗虫、抗冻、抗病、高产）
• 转基因动物
• 基因工程药物和疫苗
• 基因治疗
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小结
分子生物学技术的临床应用
• 疾病的诊断
– 感染性疾病诊断
– 肿瘤性疾病诊断
– 遗传性疾病诊断 – 组织配型和器官移植
• 基因治疗
用途广泛 功能强大
• 基因工程产品
– 转基因植物
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变性、复性、退火和淬火
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基因
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分子生物学常用技术
1. PCR（聚合酶链式反应） 2. 核酸分子杂交 3. 基因芯片技术(biochip) 4. DNA 测序（DNA sequencing ） 5. DNA重组技术(DNA recombination)
a
6
一、聚合酶链反应
（Polymerase Chain Reaction ，PCR）
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三、基因芯片技术
• 基质材料分， 有尼龙膜、玻 璃片、塑料、 硅胶晶片、微 型磁珠等。
a
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用点样法固定 在玻璃板上的DNA 探针阵列
原位合成法在玻璃等 硬质表面上直接合成 的寡核苷酸探针阵列
a
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基因芯片技术的应用
1、药物筛选和新药开发 2、疾病诊断 3、环境保护 4、司法 5、现代农业
a
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四、测序技术
（一）一代测序技术
a CTTGATCTTCAGGTAGGCCTGAAT22CCT
（二）二代测序技术
• Illumina公司的Solexa和Hiseq应该说是目前全球使用量最大 的第二代测序机器，这两个系列的技术核心原理是相同的。
• Illumina/Solexa Genome Analyzer测序的基本原理是边合成边 测序。
体外基因扩增技术
➢特异性强 ➢灵敏度高 ➢操作简单、省时 ➢对待检原始材料质量要求低 ➢高效率的基因扩增技术
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（一）PCR原理
原理
双链DNA 变性
退火 链延伸
（膜板） （双链分成单链） （膜板与引物杂交） （DNA合成）
不断重复
a
8
（二）PCR反应的设计及影响因素
PCR反应体系
Mg2+
Mn2+
a
14
样本采集要求
a
15
a
16
二、核酸分子杂交
根据核酸变性和复性 的原理，不同来源的 变性单链核酸分子在 合适的条件下，通过 碱基互补形成双链杂 交体的过程称为核酸 分子杂交 （molecular hybridization）。
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核酸分子杂交的临床应用
• 1、遗传病的诊断 • 2、病原体的鉴定 • 3、癌基因突变的检测 • 4、组织配型 • 5、亲子鉴定
• 在Sanger等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色
的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，
每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光
信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序
列信息。
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技术特点比较
• 第一代测序技术的主要特点是测序读长可达 1000bp，准确性高达99.999%，但其测序成本高 ，通量低等方面的缺点，严重影响了其真正大规 模的应用。
分子生物学常用检测技术 及临床应用
a
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DNA—四种核苷酸（A-T-C-G)组成 的多聚骨架
所有组成DNA的核苷酸 dATP,dTTP, dCTP,dGTP
都由三种成分组成： 1）一个2’-脱氧核糖（戊糖） 2）一个含氮碱基
嘌呤：A\G 嘧啶： T/C 3）三个磷酸基团
各单个核苷酸由5’和3’-碳形 成的磷酸二酯键连接在 一起
– 转基因动物
– 基因工程药物和疫苗
• 法医学方面
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基因工程的危险性
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基因的世界很奇妙， 期待你的关注和参与！
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