细胞生物学实验技术(一)(医学相关)

• 肝细胞或肾细胞，生存时间更短，仅能传几代或十几代。
• 当细胞发生遗传改变，如获永生性或恶性转化时，细胞的生
存期才可能发生改变。
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• 生命周期的三个阶段
–原代培养期 – 传代期 – 衰退期
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原代培养（Primary Culture）期
• 原代培养：从体内取出组织,分离出细胞、接种培养 到 第一次传代。
• 起源于内、外胚层的细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化 管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形态。
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• 游走细胞型：
– 散在生长，不连成片， 呈活跃游走或变形运 动，方向不规则。
– 此型细胞不稳定，有 时难以和其他细胞相 区别。
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• 多型细胞型：
– 有一些细胞，如神经 细胞难以确定其规律 和稳定的形态，可统 归于此类。
动物细胞生物学实验 技术
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主要 内容
第一节 培养细胞的细胞生物学 第二节 细胞培养 第三节 显微镜知识 第四节 细胞生物学实验技术
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第一节 培养细胞的细胞生物学
பைடு நூலகம்
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主要内容
（一）体内、外细胞的差异 （二）体外培养细胞的分型 （三）培养细胞的生长和增殖过程
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• 体外培养的细胞和体内细胞的比较
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（二）体外培养细胞的分型
– 贴附型：大多数培养细胞贴附生长，属于贴 壁依赖性细胞，判断细胞形态时不能按体内 组织学标推判定
– 悬浮型：见于少数特殊的细胞，白血病细胞， 骨髓细胞或免疫细胞，不需要细胞间和细胞 与培养表面的接触 。
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• 贴附型细胞的分类
– 成纤维细胞型 – 上皮型细胞 – 游走细胞型 – 多型细胞型
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（三）培养细胞的生长和增殖过程
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• 培养细胞的生命周期
–是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。
–种类、供体的年龄等。
• 人胚成纤维细胞可传30～50代，约150～300个增殖周期，能 维待一年左右，最后衰老凋亡（Apoptosis）。小鼠的胚胎成 纤维细胞仅可传几代
• 供体为成体或衰老个体，则生存时间较短；
时可表现出完全不同的形状。 • 细胞外基质决定细胞的形状这一作用是
通过其受体影响细胞骨架的组装而实现 的。
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3．控制细胞的分化
• 细胞通过与特定的细胞外基质成分作用 而发生分化。
– 例如，成肌细胞在纤粘连蛋白上增殖并保持
未分化的表型；而在层粘连蛋白上则停止增 殖，进行分化，融合为肌管。
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– 一般情况下当传代10～50次左右，细胞增殖
逐渐缓慢，以至完全停止，细胞进入第三期。
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• 衰退期：
– 增殖很慢或不增殖，最后衰退凋亡。
– 少数情况下，细胞可能发生自发转化（Spontaneous Transformation）。转化的标志之一是细胞可能获得永生性 （Immortality）或恶性性质（Malignancy）。这样的细胞群 体称无限细胞系（Infinite Cell Line），也称连续细胞系 （Continuous Cell Line）。
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• 4．参与细胞的迁移 • 细胞外基质可以控制细胞迁移的速度与
方向，并为细胞迁移提供“脚手架”。
• 细胞的迁移依赖于细胞的粘附与细胞骨 架的组装。细胞粘附于一定的细胞外基 质时诱导粘着斑的形成，粘着斑是联系 细胞外基质与细胞骨架“铆钉”。
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（一）体内、外细胞的差异
– 体内：神经和体液的调节、细胞间相互影响
分布在细胞表面或细胞之间的大分子，包括纤维性 成分(胶原蛋白、弹性蛋白和网织蛋白)、连接蛋白 (纤维粘连蛋白、层粘连蛋白)和空间充填分子(主要
为糖胺聚糖)等，其对细胞增殖和分化发挥重要调控 作用。
– 这些物质构成复杂的网架结构，支持并连接组织结 构、调节组织的发生和细胞的生理活动。
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1．影响细胞的存活、生长与死亡
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• 成纤维细胞型
– 梭型或不规则三角形，生长时呈放射状。 – 除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间充质起源的组织，
如心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮等常呈本型状态。 – 凡培养中形态与成纤维类似时皆可称为成纤维细胞。
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– 上皮型细胞：
• 扁平不规则多角形，彼此紧密相连。生长时呈膜状移动， 细胞很少单独行动。
– 直接接种组织块 – 由组织分离出细胞后接种
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组织块接种：牛胎儿成纤维细胞
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• 传代期：
–原代培养细胞一经传代后便改称做细胞系 （Cell Line）。此期的持续时间最长。
– 在培养条件较好情况下，细胞增殖旺盛，并 能维持二倍体核型。
– 为保持二倍体细胞性质，细胞应在原代培养 期或传代后早期冻存。
– 体外：缺乏动态平衡的稳定环境 – 发生的变化
• 分化现象减弱 • 形态功能趋于单一化 • 一定时间后死亡或者转化获得不死性
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• 体外培养的细胞仍具有研究的意义
– 许多性状仍与体内相同
• 如体外培养的心肌细胞仍可博动，
– 细胞在培养中的表现，存在相应基因关闭／ 开启引起的现象，在培养的细胞中某些特定 功能的丧失，可为该基因的表达与调控提供 线索。
正常真核细胞，大多须粘附于特定的 细胞外基质上才能抑制凋亡而存活，称 为定着依赖性（anchorage dependence）。 例如，上皮细胞及内皮细胞一旦脱离了 细胞外基质则会发生程序性死亡。
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2．决定细胞的形状 • 细胞呈单个游离状态时多呈球形。 • 同一种细胞在不同的细胞外基质上粘附
– 相似：仍存在细胞和细胞、 细胞和基质的相互关系
• 单个细胞虽能生长繁殖, 但不如群体细胞能力强， 当相邻细胞接触，便导致运动停止 细胞相互沟通生物信息的结果
• 对细胞外基质仍有依存性
– 差异：失去原有组织结构和细胞形态， 分化减弱或 不明显
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• 细胞外基质
– 存在于组织中，由细胞合成并分泌至胞外的成分，
• 原代培养细胞与体内原组织细胞在形态结构和功能上 相似性大。
• 特点
– 细胞群是异质的（Heterogeneous）
– 细胞克隆形成率（Cloning Efficiency）低，即细胞独立生 存性差。
– 由于原代培养细胞和体内细胞性状相似性大，是检测药物很 好的实验对象
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• 原代培养分为两种方法