碱性磷酸酶的分离纯化与酶学性质研究

碱性磷酸酶的分离纯化与酶学性质研究

董静 201131301031

摘要：以猪肝为原料，采用低浓度醋酸钠(低渗破膜作用)制备肝匀浆，醋酸镁则有保护和稳定AKP 的作用，匀浆中加入正丁醇可使部分杂蛋白变性，释出膜中酶，过滤后，以去除杂蛋白。含有AKP 的滤液用冷丙酮和冷乙酸进行重复分离纯化。根据AKP 在33％的丙酮或30％的乙醇中溶解，而在50％的丙酮或60％的乙酸中不溶解的性质，用冷丙酮和冷乙醇重复分离提取，可从含有AKP 的滤液中获得较为纯净的碱性磷酸酶。酶学性质研究表明该酶催化对磷酸苯二钠水解反应的最适PH值为10.0，最适温度为37℃,米氏常数值Km为3.154mmol/L，酶的热稳定性研究表明该酶在pH在8-9区间和温度在25℃-37℃区间下稳定。

关键字：碱性磷酸酶分离纯化热稳定性酸碱稳定性

碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase，EC3．1．3．1，简称AKP)广泛存在于微生物界和动物界，它在动物机体的骨化过程中及在磷化物和其他一些营养物质的消化、吸收和转运过程中起着重要作用。此外，通过催化磷蛋白的水解，碱性磷酸酶在细胞调节过程中也具有一定的作用。它可专一性的水解磷酸单酯化合物而释放无机磷，主要用于核酸研究，分析、测定核苷酸顺序及其基团的重组、分离，也是酶标免疫测定技术的常用工具酶之一。药用化妆品中添加碱性磷酸酶有益于皮肤细胞的再生和新陈代谢，还可用于核苷酸脱磷产生核苷等。它是一种膜结合蛋白，在生物体内直接参与磷酸基团的转移和代谢等生理过程[1]。临床上通过测定AKP的活力，可作为诊断骨骼及肝脏疾病的重要生化指标。因此纯化和研究AKP的性质、调控等有重要意义。本实验尝试以猪肝为材料，分离纯化猪肝碱性磷酸酶，研究其酶学性质，旨在探讨以猪肝研制科研用碱性磷酸酶生化试剂的方法，同时也为进一步的深入研究该酶提供理论上的参考。此外，猪肝来源广泛，价格便宜，可以作为生产碱性磷酸酶生化试剂的原料[2-3]。

研究酶的生物学特性，其之一是它对酸碱度的敏感性， pH对酶活性的影响极为显著，通常各种酶只有在一定的范围内才表现出活性，同一种酶在不同的pH条件下所表现的活性不同，其表现活性最高时的pH值称为酶的最适pH。pH 不仅对酶活性有很大影响，而且对酶的稳定性也有很大的影响，而且对酶的稳定性也有很大的影响。因为该酶的化学本质是蛋白质，同蛋白质容易变性一样，酶

在过酸或过碱的条件下也很容易变性失活。各种酶的酸碱度稳定范围是不同的，这就需要制作酸碱稳定性曲线[4]。

对温度的敏感性是酶的又一个重要特性。酶反应速度达到最大值时的温度称为酶的最适温度。如果保持其它反应条件恒定，而在一系列变化的温度条件下测定酶活力，以温度为横坐标，反应速度为纵坐标，可得到一条温度——酶活性曲线。酶的种类和来源不同，对热的稳定性也不同，这就需要通过热稳定性试验测出热稳定范围。一般的试验方法是在一定条件下先将酶在不同的温度下处理一段时间，迅速降温，然后再在一定温度条件下测定酶活力。以处理温度为横坐标，酶反应速度为纵坐标作图，可得到酶的热稳定性曲线，根据这条曲线即可求出酶的热稳定性范围[5]。

抑制剂是引起酶促反应速度降低的一类物质的统称。它与酶的活性部位结合，改变了酶活性部位的结构或性质，从而引起酶活力下降，这里不包括酶蛋白的水解或变性等情况。在可逆抑制类型中，根据抑制剂、底物和酶三者的相互关系，又可分为竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争性抑制三种。在竞争性抑制中，酶不能同时和底物、抑制剂结合，即不能形成EIS，其动力学特征是：米氏常数的表观值Km增加，酶的最大反应速度Vm不变。在非竞争性抑制中，抑制剂、底物都能同时和酶结合形成EIS，但是EIS不能进一步转变为产物，其动力学特征是：Vm降低而Km不变。在反竞争性抑制中，抑制剂必须在酶和底物结合以后才能和酶结合形成EIS，即Ki=∞，其动力学特征是：Km和Vm都发生了变化[6]。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1原料

菜市场购买的新鲜猪肝，由本实验室保存。

1.1.2 主要仪器

移液管；量筒；玻璃勺浆器(管)；剪刀；离心机（湘仪Cence H2050R）为湖南湘仪实验室仪器开发有限公产品；新华定性滤纸；HH数显恒温水浴锅为金

坛市金城国胜实验仪器产品；721型分光光度计（UNIC7200 SPECTROPHOTOMETER ）为国产分光光度计。 1.1.3 试剂

①0.5mol/L 醋酸镁溶液：107.25g 醋酸镁溶于蒸馏水中，定容至1000ml;②0.1mol/L 酸钠溶液:8.2g 醋酸钠溶于蒸馏水中，定容至1000ml;③0.01mol/L 醋酸镁-0.0lmol/L 醋酸钠溶液:准确吸取20ml0.5mol/L 醋酸镁溶100ml0.14mol/L 醋酸钠溶液，混合后定容至1000ml ；④tris-hcl ph8.8缓冲液：称取三羟甲基氨基甲烷12.1g ，用蒸馏水溶解后定容至1000ml ，即为0.1mol/LTris 溶液.取100ml10.1mol/LTris 溶液，加蒸馏水约780mL ，再加0.1mol/L 醋酸镁溶液100ml ，混匀后用1%冰醋酸调ph 为8.8，用蒸馏水定容至1000ml ；⑤正丁醇、丙酮、95%乙醇；⑥0.04mol/l 作用物液：称取10.16g 磷酸苯二钠，用煮沸后冷却的蒸馏水溶解，并稀释至1000ml ，加4ml 氯仿防腐，贮于棕色瓶子内，置冰箱内保存；⑦0.1mol/l 碳酸盐缓冲液（ph10.0）：称取无水碳酸钠6.36g 及碳酸氢钠3.36g 溶解于蒸馏水中，并稀释至1000ml ；⑧碱性磷酸酶液：取纯化的碱性磷酸酶5mg ，用ph10缓冲液配制成100ml ，放置冰箱内保存;⑨0.5mol/lNaOH 溶液;100.3%4-氨基安替比林:称取3g4-氨替比林及碳酸氢钠42g ，用蒸馏水溶解，并稀释至1000ml ，贮于棕色瓶中，放冰箱内保存；○

11 0.5%铁氰化钾：称取10g 铁氰化钾及30g 硼酸各溶于800ml 蒸馏水中，溶解后两液混合加水至2000ml 。置棕色瓶中，放冰箱内保存；○

12基质液：称取磷酸苯二钠·2H 2O6g,4-氨基安替比林3g ，分别溶于煮沸冷却后的蒸馏水中，两液混合并稀释至1000ml ，加4ml 氯仿防腐，于棕色瓶内，用时与等量的水混合即可;○13各ph 值相应缓冲液，○140.5mol/LKH 2PO 4：称取KH 2PO 46.80g ，加水溶解并定容至100ml ；○

150.04M 磷酸氢二钠：称取磷酸氢二钠14.3g ，溶解于0.1MpH10的碳酸缓冲液中，并用此液稀释至1000ml 。 1.2 方法 1.2.1 提取方法

分离纯化碱性磷酸酶的操作流程如下（以下操作均在0-4℃进行）