凝血酶-抗凝血酶复合物检测方法建立及初步应用

４
引
言
凝血酶一抗凝血酶复合物（ｔｈｒｏｍｂｉｎ—ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ，ＴＡＴ）是 人体内凝血和抗凝血相互作用以维持生理平衡的产物，是凝血酶 （ｔｈｒｏｍｂｉｎ，Ｔ）生成和凝血系统激活的标志物之一。
肝素（ｈｅｐａｒｉｎ，Ｈ）催化ＴＡＴ的形成，首先肝素结合抗凝血酶 （ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ，ＡＴ），形成肝素一ＡＴ二联体（Ｈ—Ｔ），使ＡＴ抗凝活性基团暴
一 经过抗体配对试验，用针对ＴＡＴ的凝血酶部位的Ⅺ号单抗作捕获抗
体，用针对ＴＡＴ之抗凝血酶部位的Ⅲ号抗体作酶标检测抗体，建立了检测
ＴＡＴ的双抗体夹心法酶联免疫吸附试验。该法的线性检测范围为
０．４—６３．Ｏ！ＬＬｇ／Ｌ，批内ｃＶ为３．９％一５．９％，批间ｃＶ为９．１％一１３．３％，回收率为
９２．６％一１０４．９％。加入２０“ｇｍｌ的ＡＴ和凝血酶原对ＴＡＴ检测无影响。检测
ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｒｏｍｂｉｎ’Ｓ ａｎｄ ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ’Ｓ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｗｉｌｌ ｅｍｅｒｇｅ．ＳＯ ＴＡＴ
ｓｈｏｕｌｄ ｈａｖｅ ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｆｒｏｍ ｔｈｒｏｍｂｉｎ ａｎｄ ａｎｔｉｔｈｒｏｌＩ虹ｉｎ．Ｂａｓｅ ０ｎ
ｔｈｏｓｅ ｃａｓｅｓ，ａｎｄ ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｏｂｔａｉｎ ｍｅｒｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｏ ＴＡＴ ｔｈｅ ｓＮｉｌｅ ｔｉｍｅ ｒｅｄｕｃｅ ｃｒｏｓｓ－ａｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｔｈｒｏｍｂｉｎ ｏｒ ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ，ｗｅ
ｓｉｔｕａｔｉｏｎｓ．
Ｂｅｈｒｉｎｇ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｉｎ Ｇｅｒｍａｎｙ ｃｏａｔｅｄ ｍｉｃｒｏｔｉｔｒａｔｉｏｎ ｐｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｈｕｍａｎ ｔｈｒｏｍｂｉｎ，ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｔｏ
ｓｕｐｐｏｓｅｄ ｔｈａｔ ｉｍｍｎｉｎｇ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ ＴＡＴ ｗｏｕｌｄ ｂｅ ｍｏｒｅ ｒｅａｓｏｎａｂｌｅ ｔｈａｎ ｔｈａｔ
ｗｉｔｈ ｔｈｒｏｍｂｉｎ ａｎｄ ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｌｙ．
Ｔｈｒｅｍｂｉｎ ａｎｄ ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ ｗｅｒｅ ｍｉｘｅｄ ｔｏｇｅｔｈｅｒ ｉｎ ｒａｔｉｏ ａｆｔｅｒ ｂｅｅｎ
、
附试验临床应用。
酶联免疫吸
Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ鼬ｄｉｍｅｎｔａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ Ｆｎｚ，ｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｏｓｏｒｂｅｎｔ
Ａｓｓａｙ ｔｏ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ Ｔｌｍ妯ｉｒｒ－ａｎｔｉｔｂｒｕｎｂｉｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ ｉｎ Ｐｌａｓｍａ
Ａｂｓｔｒａｃｔ
ｆｉｂｒｏｍｙａｍａ，ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ，ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅｓ，ａｃｕｔｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ∞ｄ
ｐｒｅｇｎａｎｃｙ．Ｔｅｓｔｉｎｇ ＴＡＴ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｔｏ ｍｏｎｉｔｏｒ ｔｈｅ ｈｉ曲ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｓｔａｔｅ ｉｎ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ，ａｃｕｔｅ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｈｅｐａｔｉｔｉｄｅｓ．
上海第二医科大学 硕士学位论文
凝血酶-抗凝血酶复合物检测方法建立及初步应用 姓名：陈红兵
申请学位级别：硕士 专业：临床检验诊断学（免疫学测定）
指导教师：罗伟 2002.5.1
凝血酶一抗凝血酶复合物检测方法的建立及其初步临床应用
中文摘要
凝血酶一抗凝血酶复合物（ｔｈｒｏｍｂｉｎ—ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ，ＴＡＴ）是 体内凝血酶原激活成凝血酶（ｔｈｒｏｍｂｉｎ，Ｚ）后，迅速被抗凝血酶 （ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ，ＡＴ）结合，生成共价键相连的无活性不可逆复合物ＴＡＴ，由 此维持凝血一抗凝血之间的生理平衡，目前认为该复合物的形成是凝血酶 生成的直接证据，标志凝血系统的激活。检测ＴＡＴ的血浆水平可以监测凝 血系统的激活情况，是研究生理病理状态下凝血系统行为的一项有用指
标。一
一、｛ＴＡＴ在形成过程中，凝血酶裂解抗凝血酶的Ａｒ９３９３－Ｓｅｒ３９４位肽键，
并以凝血酶丝氨酸活性中心Ｓｅｒ２０５结合抗凝血酶的Ａｒ９３９３位，两者构象
均发生一定的改变，呈现出一定的新抗原表位。因此，用ＴＡＴ免疫小鼠来
制备单克隆抗体可以得到针对Ｔ
高和特异性好的单克隆抗体，同
时减少与ＴＡＴ前体分子的交叉反
ｔｈｅ ｔｈｉｒｄ ａｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ（ｗｉｔｈ ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ ｃｒｏｓｓ－ｒｅａｃｔｉｏｎ）．Ｔｈｅ
ｌｉｎｅａｒ ｒａｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ａｓｓａｙ ｖｒａｓ ｆｒｏｍ ０．４ ｕ ｇ／Ｌ ｔｏ ６３．０ ｕ ｇ／Ｌ．Ｔｈｅ ｉｎｔｒａ－ａｓｓａｙ
ａｎｄ ｉｎｔｅｚ－－ａｓｓａｙ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ３．弘５．９ｊ６ ａｎｄ ９．１％￣１３．３９６ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ｎｌｅ Ｔ』盯ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅｓ ｗｅｒｅ ９２．６％ｔｏ １０４．弧Ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ
露。在血浆游离凝血酶生成后此Ｈ～Ｔ二联复合体立即与之结合，形成ＡＴ— Ｔ—Ｈ三联复合体，凝血酶酶解ＡＴ并与之形成共价键，凝血酶失活，两者构 象均有一定程度改变［１引。此后肝素脱离，稳定ＴＡＴ形成。
国外研究表明，检测ＴＡＴ对前ＤＩＣ（ｐｒｅ—ＤＩＣ）有高的敏感性和特异性 ＩＴ］，可据ＴＡＴ值对ＤＩＣ（ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ ｃｏｎｇｕｌａｔｉｏｎ，弥散 性血管内凝血）进行诊断和分级［８］。检测ＴＡＴ可预测ＤＶＴ（ｄｅｅｐ ｖｅｉｎ ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ，深静脉血栓）形成［９］，可作ＤＶＴ疗效指标“０｜。检测ＴＡＴ可对 ＡＭＩ（ａｃｕｔｅ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔ ｉｏｎ，急性心肌梗死）进行早期诊断、预测 再闭塞、考察溶栓疗效ｎ１¨］，可区分良性和恶性肿瘤、监视妇科癌症的转 移‘－５·川。可作为肝病严重程度和死亡预测指标［１８、１引。ＴＡＴ也在妊娠、感 染、类风湿病等升高［２０≈４｜。
溶酶复合物）、ＤＤ（Ｄ－ｄｉｍｅｒ，Ｄ一二聚体）、ＦＤＰ（ｆｉｂｒｉｎ（ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ）
ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ，纤维蛋白（原）降产物］显著相关。肝病、消化道 恶性肿瘤、急性白血病患者ＴＡＴ也显著升高。ＴＡＴ在预测心肌梗死、监视
妊娠、肝炎等高凝状态具有很大意义。
以上结果表明，该法可用于检测血浆ＴＡＴ。为评估生理、病理状态下
利用肝素一Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ一６Ｂ
柱从人血浆中提取凝血酶和抗凝
血酶，然后两者按一定比例体外反应，即可得到浓度和纯度均较高的ＴＡＴ
复合物（同时含有少量ＡＴ和多余的凝血酶）。以该反应的混合物免疫小
鼠，我们制备了一系列特异和非特异针对ＴＡＴ的单克隆抗体，并得到了特
望． 对ＡＴ和特异针对凝血酶的单抗。
ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎｔｉ－ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｎ＿Ｌ １ｈｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｉｓ ａ ｄｉｒｅｃｔ ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ｏｆ ｉｎ ｖｉｖｏ ｔｈｒｏｍｂｉｎ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｉｔ ｉｓ ａ ｇｏｏｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒ ｔｏ
ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｆｒｅｓｈ ｐｌａｔｅｌｅｔ ａｂｓｅｎｔ ｐｌａｓｍａ ｂｙ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ
ｏｎ ｈｅｐａｒｉｎ－ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ－６Ｂ，ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｉｓ ａｐｐｒｏａｃｈ ｗｅ ｐｒｅｐａｒｅｄ弋吼
ｂｌｅｎｄ（ｍａｉｎｌｙ ＴＡＴ ａｎｄ ａｌＳＯ ａｎｙ ｒｅｓｉｄｕａｌ ａｎｔｈｔｈｒｏｍｂｉｎ ａｎｄ ｔｈｒｏ曲ｉｎ）．Ｉｎｍｍｉｎｇ
ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ ｔｈｉｓ ｂｌｅｎｄ，ｗｅ ｐｒｅｐａｒｅｄ ａ ｐｏｏｌ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｏｒ ｕｎｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｏ ＴＡＴ，ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ ａｎｄ ｔｈｒｏｍｂｉｎ．
Ａｆｔｅｒ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｓｉｆｔｉｎｇ ｔｅｓｔ。ｗｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ａ ｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡ ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ ｔｈｅ ｅｌｅｖｅｎｔｈ ａｎｔｉｂｏｄｙ（ｗｉｔｈ ｔｈｒｅｍｂｉｎ ｃｒｏｓｓ－ｒｅａｃｔｉｏｎ）ａｓ ｃａｐｔｕｒｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ
Ａｓ ｓｏｏｎ ａｓ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｇｅｎ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｓ ｔｏ ｔｈｒｏｍｂｉｎ ｉｎ
ｂｌｏｏｄ，ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ ｒａｐｉｄｌｙ ｂｉｎｄｓ ｔｏ ｔｈｒｏｍｂｉｎ ｂｙ ａ ｃｏｖａｌｅｎｔ ｂｏｎｄ ｔｏ ｆｏｒｍ
ｉｎａｃｔｉｖｅ ｔｈｒｏｍｂｉｎ－ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ，ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｍａｉｎｔａｉｎ ｔｈｅ ｂａｌａｎｃｅ
ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ５０ ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ ｗｉｔｈ ｖａｒｉａｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ
掰？：
ｔｈａｔ，ｃ唧ａｒｅｄ Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｇｒｏｕｐ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｓｈｏｗｅｄ
ｔｏ ｎｏｒｍａｌ ｃｏｒｔｒｏｌｓ．ｈｉｇｈｅｒ １虹ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ
Ｉｎ ｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅｓｅ ｒｅｕｌｔｓ，ｗｅ ｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ
ｕｓｅｆｕｌ ｉｎ ＴＡＴ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ．Ｉｔ ｗａｓ ａｌｓｏ ａ ｕｓｅｆｕｌ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｓｔｕｄｙｉｎｇ ｔｈｅ
ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｓｔａｔｅ ｏｆ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ曲ｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ
２０Ｕｇ／ｍｌ ＡＴ ｏｒ ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｇｅｎ ｔｏ ｔｈｅ ｐｌａｓｍａ ｄｉｄ ｎｏｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
ｏｆ鼢ｌＴ．Ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｓｕｌｔｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ＥＬＩＳＡ ａｎｄ ｔｈｅ
ｃｏｍｎｅｒｃｉａｌ ＴＡＴ ｋｉｔ（ＤＡＤＥ ｉｎｃ．Ａｍｅｒｉｃａ）ｗａｓ ｗｅｌｌ㈣．９６９，ＫＯ．０００１）ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ
ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｈｍｍｎ ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ，ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ａ
Ｄ１姗ｉｎ ｓａｎｄｗｉｃｈ甩ＩＳＡ ｔｏ出ｔｅｍｉｎｅ ＴＡＴ ｉｎ
１９魄０ｕｒ ｍｅｔｈｏｄ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ
ｔｈｅ ｅｒａ ｉｎ ｃｈｉｎａ ｗｉｔｈ ｎｏ ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ＴＡＴ ｗａｓ ｏｖｅｒ，ＳＯ ｗａｓ ｔｈｅ ｅｒａ
ｉｎ ｔｈｅ ｗｏｒｌｄ ｗｉｔｈ ｎｏ ｋｉｔ ｆｏｒ ＴＡＴ ｅｎＤｌｏｙｉｎｇ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｔｈｒｏｍｂｉｎ—ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ， Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｅｎｚｙｍｅ—ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ
的凝血系统行为提供了一个有用的工具。
１９８８年德国ｂｅｈｒｉｎｇ实验室建立了ＴＡＴ检测方法，他们应用兔抗人凝
血酶的多抗作捕获抗体，用兔抗人的抗凝血酶的多抗作检测抗体。与之比
较，该法则采用亲和力和特异性均较强的单抗建立ＴＡＴ检测方法，填补了
国内ＴＡＴ检测能力的空白和国际上该方法学上的空白。
／ 。
关键词：凝血酶禽抗凝血酶复合物层折 单克隆抗体
５０例含高、中、低值的血浆标本，与用美国ＤＡＤＥ公司的试剂盒检测的结
果比较，两者相关系数为０．９６９，具有非常显著的意义（Ｐ＜Ｏ．０００１）。、丫 ／
ｆ
初步临床应用表明，健康年轻女性较健康年轻男性ＴＡＴ显著增高，孕
妇及子宫肌瘤患者ＴＡＴ显著升高。心肌梗死患者尤其是陈旧性心肌梗死患
者ＴＡＴ上升显著，且与ＰＡＰ（ｐｌａｓｍｉｎ—ａｎｔｉｐｌａｓｍｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ，纤溶酶一抗纤
ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，蚴５ ｍｏｎｉｔｏｒ ｔｈｅ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ Ｉｍｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｉｔｕａｔｉｏｎｓ．
Ｉｎ ＴＡＴ
ｏｆ ｔｈｒｏｍｂｉｎ ｂｏｎｄｓ ｔｏ Ａｒ９３９３ ｏｆ ａｎｔｉｔｈｒｃｍｂｉｎ ａｔ
ｔｈｅ ｓａｍｅ ｔｉｍｅ ｔｈａｔ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ａ ｐａｒｔ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ