_精原干细胞增殖和分化相关因子的研究进展_精原干细胞增殖和分化相关因子的研究进展

NJA中华男科学杂志
National Journal of Andrology
Zhonghua Nan Ke Xue Za Zhi
2010，17(3):268－272 http://www．androl．cn
Mini Review ·综述·
精原干细胞增殖和分化相关因子的研究进展
孙大林，张新东综述;金保方审校
(南京中医药大学男科学研究所，江苏南京210046)
【摘要】临床上，非梗阻性无精子症患者由于睾丸中没有精子而无法进行辅助生殖治疗，精原干细胞方面的研究，可能为这部分患者带来希望。

本文就近年来精原干细胞增殖分化的分子调控机制进行综述。

【关键词】男性不育;精原干细胞;增殖;分化
中图分类号:R698+．2文献标志码:A文章编号:1009-3591(2011)03-0268-05①
Molecular mechanisms of proliferation and differentiation of spermatogonial stem cells
SUN Da-lin，ZHANG Xin-dong，JIN Bao-fang
Research Institute of Andrology，Nanjing University of Traditional Chinese Medicine，Nanjing，Jiangsu210046，China
【Abstract】Clinically many patients with non-obstructive azoospermia cannot benefit from assisted reproductive technology for ab-sence of spermatozoa．However，the achievement in the studies of spermatogonial stem cells has brought hope to this cohort．This arti-cle reviews the molecular mechanisms of the proliferation and differentiation of spermatogonial stem cells，in such aspects as related genes，growth factors，and so on．Natl J Androl，2011，17(3):268－272
【Key words】male infertility;spermatogonial stem cell;proliferation;differentiation
Correspondence to:JIN Bao-fang，email:hexiking@126．com
Received:September19，2010;accepted:December20，2010
辅助生殖技术的应用，极大地改善了目前男性不育治疗上的困境，但仍有很多男性不育症患者由于睾丸中没有精子而无法进行治疗。

精原干细胞(spermatogonial stem cells，SSCs)是一群位于生精上皮基底部，具有高度自我更新和多向分化潜能的细胞，是精子发生的起始细胞。

随着SSCs的研究和广泛应用，为这部分无精子患者带来了希望，也将为少、弱精子症患者的诊治提供指导意义。

本文就近年来SSCs增殖和分化的分子调控机制所取得的进展作一综述。

精原细胞可分为A、B型。

单个未分化的A型精原细胞即SSCs，又称为A single(A s)型精原细胞，其数量仅占生殖细胞的0．03%。

A s型精原细胞可以进行自我更新，也可以分裂增殖产生2个精原细胞合胞体，称A paired(A pr)精原细胞，或生成4、8、16个精原细胞的合胞体，称A aligned(A al)精原细胞。

A al型进一步分化，依次形成A1型、A2型、A3型、A4型、In型、B型精原细胞，B型精原细胞分化则形成初级精母细胞，再分化为成熟精子。

根据增殖行为特性和功能可将精原细胞划分为3个类群:干细胞型精原细胞，即A s型;定向增殖型精原细胞，包括A pr型和A al型;分化型精原细胞，包括从A1型至B型间的各类型精原细胞。

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①作者简介:孙大林(1986-)，男，河南南阳市人，硕士研究生，从事男科学专业。

Email:daling11@126．com
通讯作者:金保方，Email:hexiking@126．com
DOI:10.13263/ki.nja.2011.03.018
1SSCs增殖
精子发生是一个复杂的过程，SSCs通过增殖分裂而最终分化为精子。

这个过程要求SSCs具有不断自我复制更新的能力，从而提供一个可以连续分化的细胞群。

小鼠从出生到性成熟，SSCs数量不断地增加，成年时SSCs数量大约有2ˑ104个，此后始终维持这个数量不变。

目前，关于SSCs如何自我更新而维持其数量稳定的机制依然不清，大量研究表明，许多基因及生长因子参与了这一过程。

1．1睾丸生精小管细胞中的胶质细胞来源神经生长因子(glial cell line derived neurotrophic factor，GD-NF)是由支持细胞(Sertoli细胞)分泌的，属于转化生长因子-β超家族的一个成员。

SSCs表达的GDNF受体复合物包括GDNF家族受体α1(GDNF family receptor alpha1，GFRα1)和受体酪氨酸激酶Ret受体。

Tadokoro等［1］利用睾丸没有生育能力的小鼠模型来研究SSCs自我更新机制，由于缺乏分化能力，从而消除了SSCs自我更新的同时产生分化成熟的子细胞的干扰。

结果发现，在高浓度的GDNF作用下，未分化精原细胞的增殖加速进行，同时还发现GDNF浓度的主要调控因素为卵泡刺激素。

有研究表明，BCL-6是一种参与调控GDNF的转录抑制基因，抑制BCL-6基因mRNA的表达将抑制SSCs的增殖，BCL-6基因缺失的小鼠，生精小管中的精原细胞发生退化变性［2］，表明其可能是通过调节GDNF 的含量而调控SSCs的增殖。

1．2早幼粒细胞白血病锌指蛋白(the promyelocytic leukaemia zinc finger，PIZF)是锌指蛋白145 (Zfp145)编码的转录抑制物，仅表达于精原细胞及未分化的SSCs中，在精子生成中发挥重要作用［3］。

对luxoid突变体小鼠的研究表明，此类小鼠只能产生少量的精子，出生后随着年龄的增长而失去所有生殖细胞。

将luxoid小鼠生殖细胞移植到W/ Wv受体小鼠后，其生殖细胞不能在受体小鼠睾丸中增殖，说明其SSCs存在内源性损伤。

Buaas等［4］发现小鼠突变体luxoid中，编码PIZF的基因包含一个无义突变，突变发生在编码PIZF的基因Zfp145，表明Zfp145调控SSCs的自我更新。

Zfp145靶向断裂小鼠随着鼠龄的变化而发生一系列的精原细胞的丢失，并伴随细胞凋亡增加和生精小管结构的变化，但Sertoli细胞不受影响［3］。

1．3TATA盒结合蛋白相关因子(TATA-binding protein-associated factors，Tafs)在RNA聚合酶II 转录调节过程中起重要作用，Taf-4b是Tafs的一个亚基。

Taf-4b缺失小鼠，在出生早期，睾丸组织结构是正常的，但是出生后3d，则表现为生殖母细胞增殖功能受损，SSCs标志性分子c-Ret、PIZF、视黄酸激活基因Stra8(stimulated by retinoic acid gene8)的表达量下降，3个月后则完全丧失了生殖能力，随之发生生殖细胞的丢失。

这些表明Taf-4b对精子发生以及SSCs增殖具有重要的作用［5］。

1．4转录因子Ets差异基因5(Ets variant gene5，Etv5)是由Sertoli细胞分泌的一种转录因子，破坏小鼠Etv5基因，可导致SSCs缺失，造成唯支持细胞综合征和无精子症。

运用微阵列分析法，同野生型(WT)小鼠相比较，Etv5(Etv5-/-)敲除的小鼠，几种趋化因子表达量和原始生殖细胞(primordial germ cells，PGCs)的迁移明显减少［6］。

Chen等［7］运用微阵列分析Etv5缺失小鼠的原始Sertoli细胞，发现调节造血干细胞龛(niche)的一些保守因子发生改变，基质细胞源性因子12(stromal cell-derived factor12，Cxcl12)，Cxcl15等趋化因子大量减少，这些趋化因子可能是调控SSCs自我更新的信号分子。

Morrow 等［8］研究表明，Etv5缺失，可能通过影响Sertoli细胞的功能，进而造成SSCs缺失，其作用机制可能是通过降低突变鼠CLDN5蛋白水平，进而损伤血睾屏障。

最近有研究表明集落刺激因子1(colony stimu-lating factor1，CSF1)是小鼠SSCs自我更新的外源性调节因子［9］，集落刺激因子1受体(colony stimu-lating factor1receptor，CSF1R)在富含THY-1+标记的SSCs中表达增强。

在加入CSF1的培养基中，SSCs增殖明显增强。

Sada等［10］研究表明RNA结合蛋白Nanos2是SSCs增殖调控的重要蛋白，用谱系追踪分析法发现未分化的SSCs表达Nanos2，出生后Nanos2缺失小鼠发生SSCs耗竭，高表达Nanos2则发生未分化SSCs的富集。

2SSCs分化
SSCs分化要经历3个关键点，第一个关键点是从A s到A pr精原细胞，生殖细胞由一些体积逐渐变大且相互间有联系的细胞克隆组成，从Apr以后所有细胞分裂后，其子细胞都以细胞间桥相联系;第二步分化是从A al到A1精原细胞，这一步在细胞行为方面发生了显著的变化，细胞周期开始缩短，细胞增殖的方式也发生了改变;第三个关键点是从A1到B 型精原细胞，精原细胞克隆呈现高度同步化，这些分裂均发生在细胞周期的特定阶段。

在正常生精上皮中，SSCs自我更新和分化的比率基本上是1ʒ1，若自我更新多于分化将使生精小管上皮只剩下干细胞，此时便可能形成肿瘤。

但是如果分化占优势，那么干细胞将被耗尽，导致生精小管中只有支持细胞［11］。

调控SSCs分化的具体机理尚不明确，现从以下几个因素阐述其可能的机制。

2．1SCF/c-Kit原癌基因c-Kit的表达产物是干细胞因子(SCF)受体，对精原细胞生存与增殖分化具有重要作用。

c-Kit位于小鼠第5号染色体上，W位点编码c-Kit受体。

其配体(KL)由青灰位点(SL位点)编码，W位点或SL位点突变引起生殖细胞、黑色素细胞及血细胞发育缺陷。

睾丸中c-Kit mRNA 至少有两种形式，一种编码c-Kit受体，主要表达于精原细胞及初级精母细胞;另一种编码截短的c-Kit 受体-tr-Kit受体，主要表达于减数分裂后的生殖细胞。

移植研究发现，将正常生殖细胞移植到SL位点缺陷小鼠睾丸中，SSCs可以增殖产生As型SSCs及A
pr
型、A al型精原细胞合胞体，但不能进一步分化，这些细胞不表达c-Kit受体。

再将正常的A s型及A pr 型、A al型精原细胞移植到W位点突变小鼠的睾丸中，这些细胞又开始了既定的分化进程，这表明SCF 与c-Kit结合对于维持A型精原细胞的分化是必需的，而对于A s型及A pr型、A al型精原细胞的增殖是非必需的。

白杨等［12］研究证实c-Kit可以作为SSCs 分化的标志，在A1 A4型SSCs中表达，在调控SSCs 分化过程中具有决定作用。

越来越多资料表明，SCF/c-Kit系统通过不同途径调节SSCs的自我更新和增殖:通过使拉巴霉素敏感的PI3K→AKT→mTOR→p70S6K→CyclinD3→cdk4，cdk6→Rb发生磷酸化，SCF/c-Kit系统使c-Kit 阳性SSCs从G1期向S期过渡，如阻断PI3K与c-Kit结合，可导致精子发生障碍，造成男性不育。

研究发现MEK通路也调控生精过程，SCF/c-Kit系统激活MEK→Erk1/2→CyclinE，CyclinA2→cdk2→拮抗Rb磷酸化，控制生精过程的进程，使用U0126可以阻断MEK通路，导致SCF诱导的促有丝分裂过程的中断［13］。

2．2RA/Stra8维生素A又名视黄醇，是一个具有脂环的不饱和一元醇，通常以视黄酯的形式存在，其主要的活性衍生物是视黄酸(retinoic acid，RA)。

Chung等［14］研究发现维生素A与生殖细胞的信号传导有直接关系。

维生素A缺乏可导致A2
A
4
型精原细胞、In型和B型精原细胞以及除细线前期精母细胞外的所有类型精母细胞和精子细胞退化变性，并脱落于生精小管管腔。

睾丸生精小管中仅存留有支持细胞和少量A1型精原细胞和细线前期精母细胞。

Schrans-Stassen等［15］为维生素A缺乏小鼠注射RA，24到48h后发现原停滞于A al期的精原细胞重新启动，成功分化为A1型精原细胞，并且高表达Kit基因。

但是，关于RA的作用机制尚不清楚，因为其受体在生殖细胞和体细胞中都有分布，所以很难确定其促进SSCs分化是作用于生殖细胞还是通过Serto-li细胞起作用。

研究表明，Stra8在哺乳动物生殖细胞减数分裂起始过程中发挥着关键性作用。

体外实验证实，RA 可直接激活Stra8基因表达并诱导随后的精原细胞分化，且RA对未分化精原细胞Stra8的诱导能力明显大于分化期间的精原细胞，这是因为分化的精原细胞本身已产生大量Stra8的缘故［16］。

Stra8基因敲除的幼年雄性小鼠，其精原细胞没有表现出减数分裂前期的形态学特征，也不表达减数分裂期间染色体联会和重组等的特征分子，因而，精原细胞减数分裂无法启动，精子无法生成［17］。

RA在体内是由视黄醛脱氢酶家族成员氧化视黄醛生成，进而在细胞色素P450(cytochrome P450，CYP)氧化酶家族的作用下，生成极性更大的化合物排出体外，两个酶家族的协同作用调节着RA的浓度。

CYP酶家族现已鉴定出3个成员CYP26A1、CYP26B1和CYP26C1［18］。

研究表明，野生型小鼠胚胎E13．5时睾丸开始大量表达CYP26B1，CYP26B1降解RA，避免了RA 浓度的增加和Stra8的激活，从而保证了精原细胞的正常发育。

敲除CYP26B1基因，在E13．5时检测发现，雄性小鼠睾丸RA含量显著增加，Stra8开始表达，这造成原本不启动减数分裂的生殖细胞也开始减数分裂，但过早进入减数分裂的精原细胞随后停滞于粗线期并开始大量凋亡，出生后的雄性小鼠基本缺乏精原细胞［18］。

Suzuki［19］等研究发现Nanos2在CYP26B1表达下降后发挥对Stra8的抑制作用。

此外，调节胆酸稳态的非典型核受体SHP，也参与了这一过程，其一方面可通过表达CYP26B1降解RA，使局部RA浓度降低;另一方面可直接抑制RARs 激活诱导的转录活性，导致Stra8的表达减少，而SHP仅在出生后早期生精小管内细胞有一过性表达，性成熟期表达下降，这与性成熟过程中Stra8表达逐渐增强，减数分裂期细胞逐渐增多相一致。

2．3DAZL DAZ(deleted in azoospermia)家族主要包括Y染色体的DAZ、3号染色体的DAZL(deleted
in azoospermia-like)和2号染色体的BOULE3个基因［20］。

DAZL基因敲除鼠由于睾丸精原干细胞的减少和减数分裂早期精原细胞分化失败导致不育，缺乏DAZL基因编码的RNA结合蛋白的小鼠不发生由Aal精原细胞到Al细胞的分化［21］。

Vogel等［22］将人DAZ基因或DAZL基因转入无DAZL基因的小鼠体内，调查人类同源基因的功能，发现此两种转基因均可在细线期/偶线期促进前期精母细胞的产生，但是不能在粗线期的中期或晚期促使细胞分化。

Tung等［23］研究了3个不同地区男、女DAZL变异体与生殖细胞生成的关系，分析了存在于不同种族间的12个SNPs，发现有7个SNPs至少与卵巢早衰或绝经期年龄、总精子数和运动精子总数中的一个因素有关。

Teng等［20］研究台湾地区DAZL基因的等位基因/基因型频率、特征及单倍体型，发现5个SNPs:260A→G，386A→G，520+34C→A，584+ 28C→T和796+369G→A。

SNP386与精子发生障碍显著相关，在不育患者中主要以杂合形式存在，但这些单倍体在不同种族的分布及功能需要进一步的研究。

2．4Sohlh1(spermatogenesis and oogenesis specific basic helix-loop-helix1)是一种主要在A型SSCs 表达的转录因子，最早在Aal型SSCs中发现，在SSCs分化过程起着重要作用。

Sohlh1缺乏可阻断精原细胞分化为精母细胞而导致不育。

通过对出生7d小鼠睾丸的研究表明，Sohlh1功能缺失会导致一系列基因表达变化，如在精原细胞分裂过程中起重要作用的LIM同源基因Lhx8的表达降低，同时与精原细胞分化相关的一些基因如Kit、神经源素3(neu-rogenin3，Ngn3)和Crabp1的表达也会减少。

但是，在Sohlh1功能缺失的同时，睾丸也会表达一些特有的转录因子，如Etv5、ERM、Taf-4b和PLZF，这些基因对精原细胞的增殖和分化有着重要的作用［24］。

2．5Sox3(the SRY-box containing gene3)位于X 染色体，是转录因子HMG家族的一员，特异表达于神经干细胞和性腺中。

研究表明，Sox3缺失的雄性小鼠及雌性小鼠都表现为不育，Sox3－/+的WT C57BL/6雄性小鼠，出生前睾丸发育正常，出生10d 后就表现为生殖细胞的缺失，14d后，只存在Sertoli 细胞和未分化的精原细胞，但其促性腺激素和睾酮水平未见异常，这提示可能是Sertoli细胞或生殖细胞受损所致。

同时发现Ngn3mRNA及蛋白表达减少，而Oct4表达增多，因此推断Sox3可能是通过影响Ngn3调节精原细胞的分化［25］。

此外，多项研究表明，雄激素和温度对SSCs的分化起重要的调节作用。

3小结
随着新的实验技术和方法在SSCs研究领域的应用，人们发现越来越多的基因、调节蛋白及生长因子与SSCs增殖和分化密切相关。

SSCs的研究是近年来的热点和重点，但是，目前还存在以下问题，生殖组织内SSCs的数量太少，难以进行系统深入的研究，这就需要建立一套完整的SSCs体外分离纯化和培养体系。

其次，SSCs增殖分化的基因调控机制尚不明确，调控因子是通过何种信号传导发挥其调节作用依然不清，这都有待于进一步深入研究。

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(本文编辑:夏欣一)。