第一章染色体制片方法

在去壁低渗法中，既要使细胞壁完全被消 化，又要使染色体完好无损，掌握好酶解条 件，使之恰倒好处，便成为该步骤的技术难 点，为此，应注意如下几点：
（1）酶液浓度应控制在2.5%-5%，根 尖2.5%，幼叶、幼芽5%。
（2）酶解时间应视材料老嫩、大小和 种类而作变动，一般以3小时为基准。
（3）温度要恒定，通常用25-27℃ 。
➢ 8-羟基喹啉（8-hydroxyquinoline），多用 0.002mol/L水溶液。适宜中、小染色体，离 体处理好。优点在于显示缢痕清晰，缺点在 于中期分裂相不如其他的多，但总体优于其 他药物。
➢ α-溴萘（α-Bromonaphthalene ）,饱和液 现配最好，适于禾本科及水生植物，活体处 理。100ml加2滴即可。
原因：
a.Hcl解离时，浓度太高或温度太高或 时间太长。
b.酶处理时，酶本身不纯，杂有蛋白 酶或DNA酶。
（7）染色体周围发须，呈解螺旋状。
原因：常见于去壁低渗法制片中。
a.烤片太久。
b.烤片时，其上的固定液燃烧，导致高温所 致。
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1910年摩尔根研究果蝇的染色体以来，染色体研究 进入了鼎盛时期。
染色体的制作方法和技术始终是一大难关。在 E．B．Wilson的巨著((The Cell)的1947年版本中， H．de Winiwarter于1912和1921两次定的人的 二 倍 体 染 色 体 数 是 4 7 和 4 8 ， T．S．PainLer 于 1921和1922定的数目，单倍体是24，二倍体是48。
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2.2.7再固定、涂片
后低渗之后，可直接涂片。但因材 料膨胀软化，不易操作，故需再固定 使材料硬化。时间从十分钟至数小时 不等。
涂片时用冰冻洁片。（涂片后自然 风干或用吹风吹干片）
2.2.8染色 一.压片法染色剂： 压片法的几种染色程序：
取材→预处理→固定
2%地衣红+1mol/L Hcl 1M Hcl 1M Hcl 1M Hcl （9：1） 60±1℃ 加热或室温 加热或室温
8-羟基喹啉+放线菌酮
预处理方法 A、离体处理
即将器官、组织从母体上切割下来处理。 注意事项 1、材料要少，大≤10，小≤15 2、材料要小，切口邻近分生区，2-3mm 3、经常振摇 4、处理期间，更换预处理液 5、尽量避光处理 6、温度在20℃左右为佳，最忌高温。
B非离体处理 主要指根尖材料。 许多蔬菜和花卉的种子小、根也小。 染色体较大的植物，
原因：
为预处理不足的明显标志。即预处理 液未能阻止纺锤丝的形成和活动，使 细胞分裂过程能顺利进行到底。这主 要是预处理液变质或处理时间太短所 致。
（5）染色体发生粘连或聚集成团而 不分散。
原因：
a.预处理液浓度太高或温度太高。
b.固定时间太短。
c.软化或酶解时间太长，染色体过度 膨胀。
（6）细胞核或染色体完全解体，而 只能看见细胞壁或细胞核与染色体 只见染色成淡、残缺不全的轮廓， 有时可见到细胞核碎裂成大小不等 的碎块。
之后将酶液浓度及处理温度恒定， 只要变动处理时间便可以找到合适的 综合条件。
2.2.6后低渗
所谓后低渗即水清洗，水溶液相对于酶 溶液而言可认为是低渗液。其目的有两方 面：
（1）洗除残留酶液。
（2）使细胞进一步膨胀而有利于染色体 铺展。
一般10分钟左右，太短：不利于铺展。 太长：可能导致无细胞壁束缚的细胞因过 度膨胀而破裂，使染色体丢失。
1%地衣红压片 Feulgen反应 铁矾苏木精染 酶解
45%乙酸压片 45%乙酸 再固定 分色和压片 卡宝品红 染色和压片
1.地衣红染色压片法
该法国外应用普遍，特点：将解离与染色结 合，同步操作，很简便。
程序：地衣红+HCL于试管中→材料与染色 液加入→酒精灯加热→染色液将沸而未沸时→ 静置染色30分钟→取出材料用不含HCL的1% 乙酸地衣红压片。
缺点：细胞质易着色而影响反差。
优点：地衣红比洋红的着色力强，易于显示染色体细 微结构变化。
3.卡宝品红（石炭酸品红）染色
卡宝品红是80年代创用的一种优良的染 色体染色剂，也是目前国内应用最广的一 种植物染色体染色剂。
程序：与乙酸洋红或地衣红染色法相同。
注意：
（1）Hcl水解时间不足时，细胞质也着色， 反差降低、过长，染色体浅淡。
➢ 幼小花蕾
比茎尖有价值，因处于花粉母细胞减数分裂 之前，有用的部分是花药和子房。纵切为二 或四进行处理。
➢ 愈伤组织
因为老化和分裂的细胞混杂，所以较困难， 应以转至新的培养基，愈伤组织大量增殖时 取为适宜。
2.2.2预处理（关键）
预处理作用
➢ 抑制微管蛋白组装成纺锤丝，但并不抑制前 期的细胞分裂，因此，凡进入中期的均被阻 而不能进入后期，积累大量中期分裂相。
C、其他方法（低温处理）
适当低温，也可抑制微管蛋白的合成与组 装成纺锤体，与药物有相同功效。但适用的 作物类别少，麦类常用。
2.2.3前低渗
0.075mol/L kcl，20-30min，严格控制浓度。 作用：
利用细胞内外溶液的渗透压加大，促使细胞 膜充分膨胀，利于染色体的自由铺展。
2.2.4固定 目的：将细胞杀死，并保持染色体的固有形 态和结构，可增强细胞的透性和易于染色。 时间：＞1h。 配方： 无水乙醇：冰乙酸=3：1 甲醇：冰乙酸=3：1 95%乙醇：冰乙酸：三氯甲烷=5：3：2
（对两种方法）
1.一张优良的体细胞染色体制片的要求
（1）在一张制片上有较多的中期分裂相， 见不到后期和末期的分裂相，说明材料生 长正常，预处理也适合。
（2）染色体分散而不重叠，或少数染色体 重叠，但单个染色体的形态可以辨认，一 个没有经验的人也可准确计数。
（3）染色体不扭曲，不断裂，主缢痕和次 缢痕以及随体都清晰可见。
原因：
a.植物生长条件不良，即：无细胞分裂。
b.预处理液浓度太高，产生严重危害。
c.根尖很小，操作时把分生区当作根冠而 切除掉。
d.材料具染色体，但因染色体极小，在低 倍或中倍显微镜下观察不仔细，不善识别 等产生观察错误（初学者易犯）
（3）细胞不易分离
原因：
主要是解离时间或温度不够。
（4）虽经过预处理，制片中仍可见到 后、末期分裂相。
甲、乙醇可迅速透入细胞而使细胞失活、 硬化，并可溶解部分脂类物质。但不能沉 淀核蛋白。
冰乙酸能凝固核蛋白，为固定染色体的主 要成分。并可使细胞膨胀和软化。
这两种成分均具有防腐和保存剂作用。单 独用一种不能有优良的固定效果。
三氯甲烷的目的是提高固定液的溶脂性能。
2.2.5酶处理
压片法一般只需纤维素酶处理即可， 必要时也只需加纤维素用量的1/5-1/10。
第一章 植物染色体制片技术
郭启高
染色体是细胞核中由DNA、蛋白质和少 量RNA组成的易被碱性染料着色的一种丝 状或杆状物。也是遗传物质的载体。它可 被苏木精、蕃红、结晶紫、吉姆萨、醋酸 洋红、地衣红和孚尔根染液等染色。染色 体为细胞中最重要的遗传结构。对染色体 的结构与功能的研究一直是细胞学、遗传 学中的重大课题。
（2）材料经Hcl水解后，务必将Hcl用水彻 底洗净，方可染色，否则将不易染色。
优点： （1）分色清晰，操作简便、快速。 （2）染色剂耐保存，稳定性好，制片后颜
色耐久不褪色。 （3）可滴染，也可整体预染。 （4）适用于各类植物染色体染色。
二、去壁低渗-火焰干燥法染色
通常用2%-5%Giemsa（PH6.8-7.2） 染色几分钟至几十分钟不等。染色后， 用蒸馏水洗净、空气干燥。
2.染色体形态比较完整：染色体各组 成成分—长臂、短臂、着丝点、随体、 染色体单体的显示都比较清楚，有利 于染色体的测量与分析。
3.方法简单，不需特殊设备，不需压 片，揭盖片等程序，且Giemsa染色 后，不用树胶封片，可在显微镜下直 接观察，方便，长期保存不褪色。
2.4 制片过程中的问题及可能原因
➢ 可诱导染色体进一步缩短变直，便于染色体 分散和使染色体形态更清晰。
预处理药物的种类、特点及选择
➢ 秋水仙素（colchicine），常用浓度0.050.2%水溶液，易溶于冷水，有剧毒；高温与 照光易失效，现配现用。适用于大、中、小 染色体。
➢ 对二氯苯（p-Dichlorobenzene pDB），常 用饱和液，溶于乙醇等有机溶剂，难溶于水。 适用于大、中、小染色体，尤其适合染色体 计数；使染色体易于分散较好，但显示缢痕 较差。
原则：进行细胞分裂的分生器官、 组织或单个细胞均可。
➢ 根尖：取材方便，分生区集中 易判断。
禾本科，单子叶0.5-2cm； 双子叶，2-4cm（大），0.5-
1.5cm（小） 裸子植物，2-4cm。 提高分裂指数：同步化处理、变
温处理（4-10℃）
➢茎尖
效果比根尖差，受季节限制，分裂指数 低，不适宜用压片法。芽长0.5cm内。
农学家要了解农作物的生物学特性，不 能不掌握有关农作物的知识，而对于农作 物育种学家来说，掌握和研究植物染色体 则是工作的基础。
经过众多研究者的不懈努力，植物染色 体的研究技术得到了长足的发展,也为育种 学家提供了充分的理论依据和实践基础。
1、染色体研究技术的发展历史
1888年瓦尔德第一次提出了染色体这一名词。
注意：
（1）染色时间据材料而变，材料大或硬，延长至1小 时或更长。但不能太长，因HCL过度处理反而使染 色体着色困难。
（2）若染色太深，用45%乙酸压片，可达到适当分 色的效果。
（3）无论用1%乙酸地衣红或45%乙酸压片，之前均 不宜在酒精灯上加热，否则将褪色。
（4）若压片之后，反差不好，细胞质着色太深，则 可在酒精灯上微热以适度褪色，增加反差。
2、染色体制片技术
2.1制片方法的选择
国内外通用的制备植物染色体标本的基本方 法是压片法和去壁低渗——火焰干燥法。前 者为传统技术，后者为70年代末由陈瑞阳创 用的新方法。
国外，仍以压片为主；
在国内，两种方法都普遍应用，只是个人有 偏爱而已。
其具体的染色体制片方法如下图：
2.2制片程序
2.2.1取材（基础）
2.2.9显微摄影 采用草绿色滤镜以滤去细胞质干扰。
注意事项：
（1）前低渗植物一般不用，可动物和人都 必须。
（2）固定后固定液一定要清洗干净才能酶 解。
（3）酶解标准是看切口褐变至材料的1/2 处即可。
（4）后低渗必须采用新鲜的去离子水。
2.3 去壁低渗法的优点
1.效率高：用根尖压片法观察染色体 并不困难，但获得染色体分散好， 能供核型分析用的细胞频率较低， 特别是对染色体数目多、形态又小 的植物，用压片法是较难的。而去 壁低渗法有时一次就能得到近百个 能数清染色体的细胞。
1 9 5 6 年 J．H． 与 A．1evan 在 瑞 典 的 Hereditas 上发表‘人的染色体数’时，确切是46。
而技术上加以突破性改进的两人竟都是搞植 物细胞遗传的，而且第一作者， Tjio是一位 中国人，名字叫蒋有兴。其发表的照片质量高， 它可以使任何未经专门训练的人，不但能数清 染色体数目，而且还能给每个染色体找到它的 同源伙伴。
➢ 放线菌酮（cycloheximide）,适宜早中期染 色体供核型分析和G-带研究。20-50ppm， 小染色体用低浓度，大染色体用高浓度
➢混合处理液
对二氯苯+α-溴萘，100ml对二氯苯饱 和液加1-2滴α-溴萘，对大、中染色体 作用迅速。可在短时间内明显缩短。
秋水仙+8-羟基喹啉，等量混合。适做 核型。
（4）染色体基本处于同一平面上。 （5）染色体着色较深，细胞质无色或只染
上极为浅淡的颜色。 要达到以上高标准要求取决于两个因素：
一是取材，二是操作技术。
2.制片中存在的问题及原因
（1）制片中的细胞极少。 原因： a.材料本身很少。 b.材料软化或酶解不够。 c.材料软化或酶解过度。
（2）制片中极少甚至没有中期分裂相。
Belling（1921）创用的乙酸洋红染色压片法，带动了 以研究染色体数目、结构和行为变异与遗传的细胞遗 传学和细胞分类学的建立和发展；
Caspersson（1969）首创的染色体分带技术，揭示了 染色体的内部结构分化，使对染色体的鉴别和分析更 为准确；
同年，Gall等创建的DNA分子原位杂交技术及其以后的 不断改进，现已发展可以对单拷贝基因、重复序列以 及整个基因组DNA进行准确定性、定位和相对定量的 研究。