第十八章高效液相色谱法解读
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适用范围和离子对试剂的选择
▪ 适用范围：有机酸、碱、盐，离子型和非离子型化 合物的混合物。
▪ 分析酸类或带负电荷物质：用季铵盐，如四丁基铵 磷酸盐（TBA）和溴化十六烷基三甲基铵（CTAB） 等
▪ 分析碱类或带正电荷的物质：用烷基磺酸盐或硫酸 盐，如正戊烷基磺酸钠（PICB5）、正己烷基磺酸 钠（PICB6）、正庚烷基磺酸钠（PICB7）。
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（三）反相离子对色谱法 paired ion chromatography；PIC ion pair chromatography；IPC
▪ 把离子对试剂加入到含水流动相中，被分析的组分 离子在流动相中与离子对试剂的反离子（或称对称 离子，counter ion）生成不荷电的中性离子对， 从而增加溶质与非极性固定相的作用，使分配系数 增加，改善分离效果。
NaOH 洗脱反应：R+-X- + NaOH→R+-OH- +
NaX 抑制柱： 与组分反应：R--H+ + NaX→R--Na+ + HX
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三、其他高效液相色谱法
（一）离子色谱法 离子色谱法是由离子交换色谱法派生出来的 一种分离方法。 离子色谱法可分为两大类：抑制型（双柱型） 和非抑制型（单柱型） 以分析阴离子X-为例： 分离柱：填有低交换容量的阴离子交换剂 抑制柱：填有高交换容量的阳离子交换剂 （称为阴离子抑制柱）。
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两柱上的反应： 分离柱： 交换反应：R+-OH- + NaX→R+-X- +
流动相的pH降低，弱酸k增大，tR增大； 弱碱k变小。
13
▪ 离子抑制色谱法（ion suppression chromatography；ISC ）
▪ 用少量弱酸、弱碱或缓冲溶液，调节流动相的pH， 抑制有机弱酸、弱碱的离解，增加疏水缔合作用，
使k变大。
▪ 适用于3≤pKa≤7的弱酸、7≤pKa≤8的弱碱
▪ 高压输液泵输送流动相，流速快，分析速度快； ▪ 高灵敏度检测器，灵敏度大大提高。紫外检测器
最小检测限可达109g，而荧光检测器最小检测 限可达1012g。
3
与气相色谱法相比
▪ 不受试样的挥发性和热稳定性的限制，应用范围 广；
▪ 可选用各种溶剂作为流动相，对分离的选择性有 很大作用，选择性高；
▪ 一般在室温条件下进行分离，不需要高柱温。
A
m
EBA
A
m
16
影响保留因子的因素
➢ 离子对试剂的种类和浓度： 在反相离子对色谱中，离子对试剂碳链长度增
加，溶质的k增大； 在一定范围内试剂的浓度升高，溶质的k增大
➢ 流动相的pH：有利于组分和离子对试剂离子化时
（离子对的形成），组分的k值最大
➢ 固定相 、流动相性质（同一般RP-HPLC）。
第十八章 高效液相色谱法 HPLC
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▪ 经典液相色谱法为基础; ▪ 引入气相色谱法的理论和实验技术; ▪ 高压输送流动相; ▪ 高效固定相及高灵敏度检测器;
▪ 现代液相色谱分析方法。
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与经典液相色谱法相比
▪ 颗粒极细（一般为10m以下）、规则均匀的固 定相，(键合相)传质阻抗小，柱效高，分离效率 高；
▪ 用于分Hale Waihona Puke Baidu可离子化或离子型化合物。
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▪ 离子对模型
流动相
B + H+ ↔ BH+ +
RSO3Na↔RSO3- + Na+
固定相
通式
(BH+·RSO3-）m
(BH+·RSO3-）s
离子对 Bm+ + Am-↔（B+·A-）m↔（B+·A-）s
KB
[B A [B ]m
]s
[B A ]s [B ]m[A ]m
➢ 2、固定相
键合烷基的疏水性随碳链的延长而增加，溶质的k
也增大。
硅胶表面键合烷基的浓度越大，则溶质的k越大。
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➢ 3、流动相
极性越强，洗脱能力越弱，使溶质的k越大
溶剂种类：水为弱溶剂，醇为强溶剂
溶剂比例：水的比例增加，使k增大 中性盐的加入：使中性溶质的k增大
pH：影响弱酸、弱减的离解
▪ 以化学键合相为固定相的色谱法，简称键 合相色谱法(bonded phase chromatography；BPC)
▪ 化学键合相：采用化学反应的方法将官能 团键合在载体表面所形成的固定相
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➢ 优点： 固定相的均一性和稳定性好，在使用过程中不易 流失，使用周期长； 柱效高；重现性好； 能使用的流动相和键合相的种类多，分离的选择 性高
4
第一节 高效液相色谱法的主 要类型和原理
➢一、主要类型 四类基本类型色谱法
➢分配色谱法（partition chromatography） ➢吸附色谱法（adsorption chromatography） ➢离子交换色谱法（IEC） ➢分子排阻色谱法（SEC）
➢化学键合相色谱法
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二、化学键合相色谱法
溶质的保留主要是溶质分 子与极性溶剂分子间的排 斥力，促使溶质分子与键 合相的烃基发生疏水缔合。 不是溶质分子与键合相间 的色散力，
11
▪ 保留行为的主要影响因素 ➢ 1、溶质的分子结构（极性）
极性越弱，疏水性越强，k越大，tR也越大。 同系物碳数越多，极性越弱，k越大； 引入极性取代基，降低疏水性，k值变小。
▪ 适用范围：溶于有机溶剂的极性至中等极性的分 子型化合物
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正相键合相色谱法
分离机制： 分配：把有机键合层作为一个液膜看待，溶质 在两相的溶解 吸附：溶质与键合极性基团间的诱导、氢键和 定向作用
▪ 分离选择性：
➢ 极性强的组分k大，后洗脱出柱。 ➢ 流动相的极性增强，洗脱能力增加，使组分k
减小，tR 减小。
正相（normal phase，NP）和反相（reversed phase，RP）键合相色谱法：
根据化学键合相与流动相极性的相对强弱
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（一）正相键合相色谱法
▪ 固定相：极性键合相 ➢ 如氰基（－CN）、氨基（－NH2）或二羟基 键合硅胶。（经典：水饱和的硅胶）
▪ 流动相：非极性或弱极性溶剂加极性调整剂 ➢ 如烷烃加醇类。（与水不混溶的溶剂）
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（二）反相键合相色谱法
▪ 固定相：非极性键合相 ➢ 如十八烷基硅烷（C18，ODS）、辛烷基（C8） 键合硅胶
▪ 流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的 极性调整剂 ➢ 常用甲醇－水、乙腈－水等 应用：最广。非极性至中等极性的组分，（还有 有机酸、碱及盐等）
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保留机制 疏溶剂理论（solvophobic theory）
适用范围和离子对试剂的选择
▪ 适用范围：有机酸、碱、盐，离子型和非离子型化 合物的混合物。
▪ 分析酸类或带负电荷物质：用季铵盐，如四丁基铵 磷酸盐（TBA）和溴化十六烷基三甲基铵（CTAB） 等
▪ 分析碱类或带正电荷的物质：用烷基磺酸盐或硫酸 盐，如正戊烷基磺酸钠（PICB5）、正己烷基磺酸 钠（PICB6）、正庚烷基磺酸钠（PICB7）。
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（三）反相离子对色谱法 paired ion chromatography；PIC ion pair chromatography；IPC
▪ 把离子对试剂加入到含水流动相中，被分析的组分 离子在流动相中与离子对试剂的反离子（或称对称 离子，counter ion）生成不荷电的中性离子对， 从而增加溶质与非极性固定相的作用，使分配系数 增加，改善分离效果。
NaOH 洗脱反应：R+-X- + NaOH→R+-OH- +
NaX 抑制柱： 与组分反应：R--H+ + NaX→R--Na+ + HX
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三、其他高效液相色谱法
（一）离子色谱法 离子色谱法是由离子交换色谱法派生出来的 一种分离方法。 离子色谱法可分为两大类：抑制型（双柱型） 和非抑制型（单柱型） 以分析阴离子X-为例： 分离柱：填有低交换容量的阴离子交换剂 抑制柱：填有高交换容量的阳离子交换剂 （称为阴离子抑制柱）。
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两柱上的反应： 分离柱： 交换反应：R+-OH- + NaX→R+-X- +
流动相的pH降低，弱酸k增大，tR增大； 弱碱k变小。
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▪ 离子抑制色谱法（ion suppression chromatography；ISC ）
▪ 用少量弱酸、弱碱或缓冲溶液，调节流动相的pH， 抑制有机弱酸、弱碱的离解，增加疏水缔合作用，
使k变大。
▪ 适用于3≤pKa≤7的弱酸、7≤pKa≤8的弱碱
▪ 高压输液泵输送流动相，流速快，分析速度快； ▪ 高灵敏度检测器，灵敏度大大提高。紫外检测器
最小检测限可达109g，而荧光检测器最小检测 限可达1012g。
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与气相色谱法相比
▪ 不受试样的挥发性和热稳定性的限制，应用范围 广；
▪ 可选用各种溶剂作为流动相，对分离的选择性有 很大作用，选择性高；
▪ 一般在室温条件下进行分离，不需要高柱温。
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EBA
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影响保留因子的因素
➢ 离子对试剂的种类和浓度： 在反相离子对色谱中，离子对试剂碳链长度增
加，溶质的k增大； 在一定范围内试剂的浓度升高，溶质的k增大
➢ 流动相的pH：有利于组分和离子对试剂离子化时
（离子对的形成），组分的k值最大
➢ 固定相 、流动相性质（同一般RP-HPLC）。
第十八章 高效液相色谱法 HPLC
1
▪ 经典液相色谱法为基础; ▪ 引入气相色谱法的理论和实验技术; ▪ 高压输送流动相; ▪ 高效固定相及高灵敏度检测器;
▪ 现代液相色谱分析方法。
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与经典液相色谱法相比
▪ 颗粒极细（一般为10m以下）、规则均匀的固 定相，(键合相)传质阻抗小，柱效高，分离效率 高；
▪ 用于分Hale Waihona Puke Baidu可离子化或离子型化合物。
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▪ 离子对模型
流动相
B + H+ ↔ BH+ +
RSO3Na↔RSO3- + Na+
固定相
通式
(BH+·RSO3-）m
(BH+·RSO3-）s
离子对 Bm+ + Am-↔（B+·A-）m↔（B+·A-）s
KB
[B A [B ]m
]s
[B A ]s [B ]m[A ]m
➢ 2、固定相
键合烷基的疏水性随碳链的延长而增加，溶质的k
也增大。
硅胶表面键合烷基的浓度越大，则溶质的k越大。
12
➢ 3、流动相
极性越强，洗脱能力越弱，使溶质的k越大
溶剂种类：水为弱溶剂，醇为强溶剂
溶剂比例：水的比例增加，使k增大 中性盐的加入：使中性溶质的k增大
pH：影响弱酸、弱减的离解
▪ 以化学键合相为固定相的色谱法，简称键 合相色谱法(bonded phase chromatography；BPC)
▪ 化学键合相：采用化学反应的方法将官能 团键合在载体表面所形成的固定相
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➢ 优点： 固定相的均一性和稳定性好，在使用过程中不易 流失，使用周期长； 柱效高；重现性好； 能使用的流动相和键合相的种类多，分离的选择 性高
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第一节 高效液相色谱法的主 要类型和原理
➢一、主要类型 四类基本类型色谱法
➢分配色谱法（partition chromatography） ➢吸附色谱法（adsorption chromatography） ➢离子交换色谱法（IEC） ➢分子排阻色谱法（SEC）
➢化学键合相色谱法
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二、化学键合相色谱法
溶质的保留主要是溶质分 子与极性溶剂分子间的排 斥力，促使溶质分子与键 合相的烃基发生疏水缔合。 不是溶质分子与键合相间 的色散力，
11
▪ 保留行为的主要影响因素 ➢ 1、溶质的分子结构（极性）
极性越弱，疏水性越强，k越大，tR也越大。 同系物碳数越多，极性越弱，k越大； 引入极性取代基，降低疏水性，k值变小。
▪ 适用范围：溶于有机溶剂的极性至中等极性的分 子型化合物
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正相键合相色谱法
分离机制： 分配：把有机键合层作为一个液膜看待，溶质 在两相的溶解 吸附：溶质与键合极性基团间的诱导、氢键和 定向作用
▪ 分离选择性：
➢ 极性强的组分k大，后洗脱出柱。 ➢ 流动相的极性增强，洗脱能力增加，使组分k
减小，tR 减小。
正相（normal phase，NP）和反相（reversed phase，RP）键合相色谱法：
根据化学键合相与流动相极性的相对强弱
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（一）正相键合相色谱法
▪ 固定相：极性键合相 ➢ 如氰基（－CN）、氨基（－NH2）或二羟基 键合硅胶。（经典：水饱和的硅胶）
▪ 流动相：非极性或弱极性溶剂加极性调整剂 ➢ 如烷烃加醇类。（与水不混溶的溶剂）
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（二）反相键合相色谱法
▪ 固定相：非极性键合相 ➢ 如十八烷基硅烷（C18，ODS）、辛烷基（C8） 键合硅胶
▪ 流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的 极性调整剂 ➢ 常用甲醇－水、乙腈－水等 应用：最广。非极性至中等极性的组分，（还有 有机酸、碱及盐等）
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保留机制 疏溶剂理论（solvophobic theory）