酪蛋白粗提取实验报告

酪蛋白粗提取实验报告

篇一：实验一蛋白质含量测定方法的研究

生物化学实验预习报告

实验一蛋白质含量测定方法的研究

一、研究背景

蛋白质含量的测定广泛应用于生产实践、医药卫生等各个领域，如测定牛奶等食品中蛋白质的含量作为其营养成分的参考值，测定病人尿液中蛋白质的含量以检测其是否患有某种疾病等，因而测定蛋白质的含量具有非常重要的意义。由于蛋白质本身具有一系列的特点（如具有等电点、富含有机氮、含有肽键、存在某些含共轭双键的氨基酸残基、可与某些染料结合等），利用它的这些特点可以通过特定的化学反应或者某些物理手段，将一定量的蛋白质转化为可以方便定量测定的其他量，从而达到测定蛋白质含量的目的。蛋白质诸多特点的存在决定了它会有不同的测定方法，同时由于多种非蛋白组分的存在和干扰以及各种方法本身的局限性（适用条件），每一种测定方法都有各自的优缺点，某一种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，所以多种测定方法的共存是有意义的。目前常用的蛋白质含量测定方法有四种：凯氏定氮法、Folin-酚法、考马斯亮蓝（G-250）

法、紫外法，其中后三种方法最常用。在实际工作中，需要根据所测定对象的具体情况综合考虑各种因素(如实验器材的限制、实验所要求的灵敏度和精确度、所测定蛋白质的种类与性质、溶液中存在的干扰物质、测定所花费的时间等)，有选择性地使用某种方法。

二、研究目标

1.掌握常用的蛋白质含量测定方法的原理和操作流程；（基础目标）

2.了解不同测定方法的优点和局限性，掌握在实际工作中不同测定方法的选择条件；（基础目标）

3.证明非蛋白组分在蛋白质含量测定中存在干扰，并通过分析实验结果确定该干扰在实际工作中是否可以忽略。（高级目标）

三、研究策略

本实验最重要的目的是为了确定非蛋白组分在蛋白质含量测定中存在的干扰是否可以忽略。思路有两种：一种方法是先测定纯蛋白质溶液中蛋白质含量，随后在该溶液中加入非蛋白组分（如嘌呤、嘧啶等吸光物质，Ca2+等金属离子，无机酸或无机碱，甚至某些色素等），测定此时蛋白质含量，对比两次测定结果，计算相对误差，从而得出非蛋白组分的影响程度；另一种方法是直接使用天然的蛋白质粗提取物

（含有非蛋白组分，并将其中包含的所有非蛋白组分看成一个影响因素），来测定粗提取物中的蛋白质含量。考虑到第一种方法中涉及到的非蛋白组分的加入量没有标准，这些非蛋白材料（影响因素）实验室内也不一定有，更重要的是该实验所具有的实际意义不大，故决定采用第二种方案。但是方案二所存在的一个问题是所测组分蛋白质含量的真实值未知，测得的结果没有可以参考比较的依据，所以需要另外找一个可以参考的标准。

所采取的策略是先用不同的方法测定已

知标准蛋白质溶液的浓度，三个测定值之间会有一定的相关性（或者说测定值之间的变化符合某种趋势），随后测定天然样品蛋白质粗提取液中蛋白含量，得到另外三个测定值，这三个测定值之间同样会存在一定的相关性。如果这两个相关性关系（或者说变化趋势）大致相同，则认为非蛋白组分的影响很小，可以忽略，相反则不能忽略。具体分以下五步走：

1.分别用紫外法、Folin-酚法、考马斯亮蓝（G-250）法对标准牛血清白蛋白溶液绘制标准曲线；

2.结合各标准曲线，用三种方法分别测定待测样液1（待测液1A，500μg/ml BSA、待测液1B，250μg/ml BSA、待测液1C，100μg/ml BSA、待测液1D，10μg/ml BSA）各组

中蛋白质的含量；

3.用三种方法分别测定待测样液2（生物样品的蛋白质粗提取液，含非蛋白组分）的蛋白质含量；

4.对比分析在不同稀释倍数下使用各种方法测定的样液1中各组蛋白质的含量值，与真实值相比较并计算相对误差，得出不同测定方法的精确度或者所适宜测定的蛋白质浓度范围；

5.将不同方法测定的样液1及样液2蛋白质含量值分别绘制成曲线图，对比分析两条曲线的波动趋势或相似程度，若波动趋势大致相同，则说明非蛋白组分在蛋白质含量测定中的影响可以忽略；若波动趋势明显相差较大，则非蛋白组分在蛋白质含量测定中的影响不能忽略。

四、研究方案及可行性分析

1.实验原理与技术

（1）凯氏定氮法

原理：样品中含氮有机化合物与浓硫酸在催化剂作用下共热消化，含氮有机物分解产生氨，氨又与硫酸作用,变成硫酸铵。然后加碱蒸馏放出氨，氨用过量的硼酸溶液吸收，再用盐酸标准溶液滴定求出总氮量换算为蛋白质含量。总体上分为样品消化、蒸馏、吸收和滴定四个过程。

优点：是一种蛋白质的经典测定方法，适用广泛，可用于动植物各种组织、器官及食品等组成复杂的样品测定；测定结果准确，重现性好，往往将该方法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白，该方法也是目前分析有机化合物含氮量最常用的方法。

缺点：灵敏度低，0.2~1.0mg/ml；蒸馏与吸收操作装置较复杂，不便于操作；实验过程所需时间较长，操作费时；因实验过程会产生有毒气体，通常需在通风橱中进行样品消化，另外样品与浓H2 SO4 共热，有一定危险。

基于上述操作的不便性及危险性，本次实验不使用该方法测定蛋白质含量。

（2）紫外法

原理：在蛋白质分子中，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质，且吸收峰在280nm处，在该波长范围内，其吸光度（即光密度值OD280）与蛋白质含量（浓度）呈正比关系，故可进行蛋白质含量的测定。

优点：简便、灵敏、快速，50~100μg/ml；低浓度盐类不干扰测定；不消耗样品，测定后样品仍能回收使用。

缺点：准确度较差，干扰物质多。在用标准曲线法测定

蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸、色氨酸含量差异较大的蛋白质有一定的误差，故该方法适用于测定与标准蛋白氨基酸组成相似的蛋白质；若样品中含有嘌呤、嘧啶以及核酸等吸收紫外光的物质时，会出现较大的干扰，需进行矫正，但不同蛋白质及核酸的紫外吸收值不同，虽经过矫正但还是存在一定的误差；在测定时，由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化，因此需要注意溶液的pH，且测定样品时pH要与测定标准曲线时相一致；该方法适于测无色样品，对有色样品需进行预处理，排出颜色干扰之后才能使用此方法。[1]

（3）Folin-酚法（Lowry法）

原理：该方法根据蛋白质侧链基团中的特殊残基进行含量测定，其基础是蛋白质中所含的酪氨酸、色氨酸等残基数目与蛋白质含量成正比。首先由Folin-酚试剂甲（相当于双缩脲试剂）中的Cu++离子在碱性条件（pH10）下与蛋白质中的肽键形成络合物，然后加入试剂

乙（磷钨酸和磷钼酸的混合液）使其被蛋白质中的含有酚基的氨基酸残基还原为钼蓝和钨蓝的混合物，呈现出蓝色反应。反应颜色的深浅与蛋白质含量呈正比，据此可测定蛋白质的含量。

优点：反应灵敏，10~200μg/ml，灵敏度为紫外法的