人类染色体疾病诊断三

２）简单重复序列探针(simple repetitive probes）
其靶序列为α卫星DNA或卫星III DNA(alpha satellite/satellite III DNA)多位于染色体的着丝粒， 异染色质区域和端粒，重复数百次至数千次。
特点：信号强 应用： (a)标记染色体识别 (b)染色体数目异常检测 (c)同时由于G显带时，端粒区是苍白的，因此涉
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四、FISH的临床应用
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1.在细胞遗传学检查中，重复序列的探针应用最多， 它们是α卫星DNA、β卫星DNA和经典卫星DNA探 针。 α卫星DNA探针主要检测人染色体的着丝粒。 β卫星DNA位于顶端着丝粒染色体及染色体的异 染色质 周围。 经典卫星DNA有着AATGG短片段，位于染色体 1、9、15、16和Y染色体长臂异染色质周围，后 两处探针除了可用于染色体数目检查外，还可用 于上述部位精细改变的检查。
第五节 荧光原位杂交（FISH）
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染色体显带技术的优缺点
染色体显带是细胞遗传学分析技术中不 可替代的基本方法。“金标准”
操作简便，经济 可以提供核型的完整图像
影响因素：
染色体相似性很强，复杂畸变时；或畸变微小（如缺 失<5Mb)，不足以引起图像明显变化时，结果分析困 难。
因为血清学筛查主要针对21、18、13一三体发病风险 的统计，80％的常见染色体异常发生在2l、18、l3、X 及Y这5对染色体，而FISH针对这些血清学异常已达 到很高的特异性及敏感性，且FISH的快速简便，可以 极大的缓解孕妇的焦虑情绪。
单体）
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FISH检测21三体综合征结果
左图：以13（绿色）21（红色）为探针，显示 13号和21号染色体为正常； 中图及右图：21三体综合征病例的FISH结果， 有三个红色信号（21号）。
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对于临床来说，对母血清唐氏筛查异常的高危 孕妇，可以考虑选择FISH检测。
耗时（培养需72小时）且依赖于获得良好的分裂相， 而有的标本中分裂指数低，或染色体形态学表型差。
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一、FISH原理
（一）、几个概念
杂交 原位杂交 荧光原位杂交
依原据位D杂N交A双链碱基互补、变性 和(in复s性itu原h理yb，ri用di已za知tio碱n)基是序用列已 的标单记链的核核酸酸片探段针作与为组探织针切检片测或 样细本胞中中是的否待存测在核与酸其中互的补互的补同序 源列核杂酸交序,从列而，对这组一织过细程胞叫中做的杂 交核。酸进行定性、定位和相对定 量分析。
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探针标记
在已知探针DNA结构及序列情况下可采用 PCR或RNA逆转录法标探针。通常用Biotin 标记的探针应大于100bp，较小的探针可采 用PCR技术来标记。
近年来，VYSIS公司成功的生 产了大片段的 DNA探针（100─400kb）。由于探针较长， 故可将荧光物质直接标记在核苷酸上，这不 仅使杂交过程进一步简化面且杂交信号增强。
三、FISH探针
（一）、直接标记和间接标记
用生物素或地高辛标记称为间接标记。
杂交后需要通过免疫荧光抗体检测方能看到荧光信号。
优点：在信号较 弱或较小时可经抗 原抗体反应扩大 缺点 步骤较多, 操作麻烦。
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直接用荧光素标记DNA的方法称为直接标记。
优点：由于直接标记的探针杂交后可马上观察到荧光信 号, 省去了烦琐的免疫荧光反应。由于近年来荧光素的亮度 和抗淬灭性的不断改进和提高, 直接标记的荧光探针应用越 来越多。
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（二）、FISH探针的种类
1）单拷贝探针： （1）种类：酵母人工染色体（YAC），细
菌人工染色体（BAC），Cosmid， Plasmid，cDNA片段 （2）应用 （a）定位DNA片段及嵌合体克隆验证； （b）确定染色体微小缺失与重复； （c）染色体断裂点分析。
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2.方法敏感，能迅速得到结果。 3.在同一标本上，可同时几种不同探针，显示
DNA片段及基因之间的相对位置与方向，空间 定位精确；可以检测隐匿或微小的染色体畸变 以及复杂核型。
4.不仅可用于分裂细胞染色体数量或结构变化的研 究，而且还可用于静止期细胞的染色体数量及 基因改变的研究。
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它可用于标记染色体的识别、特异融合基 因的检测，并可广泛用于肿瘤的诊断分型， 新基因定位，用全染色体涂抹探针识别复 杂的染色体结构异常等。
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原理：通过观察荧光信号在染色人类体染上色体的疾病位诊断置三来反映相应基因的情况。
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二、FISH的优点：
1.操作简便，探针标记后稳定，一次标记后可使用 二年。
hybridization, FISH)**
同位素原位杂交的不足： 1）不稳定；2）高背景；3）曝光时间长；4）结果统计
学处理繁琐;5）同位素的使用和处理
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荧光原位杂交（FISH）
FISH技术是常规染色体分析的辅助手段。 它是用荧光素标记特异探针，与染色体做 杂交后，根据特异的荧光信号来判断结果。
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原位杂交
1）同位素原位杂交(Isotopic in situ hybridization)——70年代
2）非同位素原位杂交(Non-isotopic in situ hybridization)——80年代中后期
（1）免疫酶联 （2）荧光原位杂交（Fluorescence in situ
及此区的易位常难以检测，而应用端粒探针则 弥补了G显带的不足人类染色体疾病诊断三
3）染色体涂染探针（chromosome painting probes)
整条染色体探针或染色体区带特异性探针 包括通过流式细胞仪（FACS）分选或显微切割 获得的全染色体，染色体臂，或染色体特异性区带涂抹
探针
应用： 检测染色体数目或结构异常。
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染色体着丝粒荧光
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染色体端粒荧光
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FISH检测18三体及Turner综合征结果
左图： 18（蓝色）X(绿色)Y（红色）探针，显示18号、
X和Y染色体为正常；
中图：18三体综合征病例的FISH结果，有三个蓝色信号
（18号）；
右图：Turner综合征病例的FISH结果，1个绿色信号（X