杆状病毒介绍
昆虫表达系统介绍
杆状病毒是已知昆虫病毒中最大的类群发现最早、研究最多且实用意义也是最大的昆虫病毒。
杆状病毒表达载体系统Baculovirus expression vector systemBEVS自1983年问世以来Smith Summer1983Maeda et al 1984由于其具有高效的表达能力、安全易操作等特点已成为研究和生产各种原核、真核蛋白的用力而普及的工具已成功表达了大量的外源基因几乎覆盖了所有物种可开发利用的大部分基因。
1 分类杆状病毒——有囊膜的双股DNA大型病毒仅限于无脊椎动物有尾噬菌体目Caudovirales 杆状病毒科Baculoviridae 核型多角体病毒属NucleopolyhedrovirusNPV ———苜蓿蠖核型多角体病毒Autographa Californica NPV ———家蚕核型多角体病毒Bombyx mori MPV 颗粒体病毒属GranulovirusGV ———苹果蠹蛾颗粒体病毒Cydia pomonella GV 多角体与颗粒体的区别NPV和GV均有包涵体形式NPV的称多角体后者称为颗粒体多角体内含有许多病毒子都在宿主细胞核内存在颗粒体内含一个病毒子偶尔是两个绝大部分在核内形成但某些GV在胞浆中形成颗粒体2 发育循环杆状病毒包含两个独特的时相又称双相生活循环biphase life cycle 第一相出现在PI0-24hr 核衣壳于胞核内病毒发生基质上进行装配通过细胞质出芽获得囊膜这种病毒称为细胞释放型病毒子Cell-released virusCRV又称胞外型病毒Extracellular virusECV或出芽型病毒Budded virusBV 第二相出现在PI20-72hr 当20hr后核内出现病毒包涵体时第二相显著出现一直持续到感染细胞溶解为止72hr 随着第二相开始CRV急剧减少从第二相开始留在核内的核衣壳被封入核内新装配的囊膜中以后许多核内获得囊膜的病毒子被包埋入多角体蛋白的结晶基质中逐渐形成多角体。
杆状病毒1
杆状病毒的研究进展1．杆状病毒作为基因治疗载体的研究进展：将基因高效导入细胞是基因治疗的技术关键。
我们构建了一个含有CMV启动子启动的绿色荧光蛋白基因的重组AcMNPV，并用其作为基因转移载体转导哺乳动物原代椎间盘细胞。
AcMNPV介导报告基因－绿色荧光蛋白基因在该原代细胞中能高效表达，200 MOI时病毒在该细胞中表达报告基因百分比最高（87%），且表达时相可持续较长时间，此外，杆状病毒的转导对细胞没有明显毒性。
体内实验表明，杆状病毒能有效、无毒地转导兔椎间盘细胞。
另外，通过比较杆状病毒介导的外源性基因在正常髓核细胞与退变髓核细胞中的表达，发现两者之间无明显差异，均能高水平表达。
因此，杆状病毒转染椎间盘髓核细胞的效率与椎间盘退变程度无关。
由此可见，杆状病毒在作为椎间盘疾病的基因治疗转移载体方面，具有巨大的潜力。
进一步通过体内外实验还发现，杆状病毒能进入人椎间盘细胞中并介导外源基因的高效表达，尤其是Sox9基因的表达，对于治疗椎间盘退化具有明显效果。
进一步证实了杆状病毒作为高效、安全的基因治疗载体的应用前景，该研究成果发表于国际医学权威杂志SPINE上（Liu et al., 2006）。
同时，我们发现杆状病毒能刺激哺乳动物细胞产生非特异的免疫反应，并对其机制进行了研究（Liang et al., 2006）；分析了杆状病毒转导家禽细胞以及组织的特性和转导机制（Song et al., 2006）；并且，我们还发展了一类新型的基于杆状病毒F蛋白的真核表面展示系统，为具有自主知识产权的靶向性基因治疗载体的构建进行了有益的探索（Mao et al., 2006）。
2．杆状病毒为载体的基因工程疫苗的研究：我所对乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）的杆状病毒疫苗进行了初步研究：利用细菌和昆虫病毒表达系统成功地表达了HCV的E2和NS2蛋白，并分析了其免疫学特性（刘超红等，2006）；构建了插入1.3倍HBV全基因组的重组杆状病毒，在哺乳动物细胞中获得了HBVS抗原和E抗原的表达，并产生病毒颗粒（于德敏等，2006）；利用杆状病毒构建了SARS CoV 类病毒颗粒（VLP）并对其免疫学特性进行了详细的研究，以期为SARS CoV疫苗研究提供一个安全、有效的方法，并为SARS CoV组装的基础研究提供技术平台（Lu et al., submitted）；同时，我所还与华中科技大学同济医学院积极合作，开展了血吸虫杆状病毒疫苗的研究（Yu et al., 2006），发现以杆状病毒载体为基础的基因工程疫苗与蛋白疫苗联合应用获得的免疫效果和保护效果最佳，为血吸虫的免疫接种提供了新的途径及策略，具有良好的开发应用价值。
杆状病毒——昆虫细胞表达系统
实验材料：1. 重组杆状病毒质粒：Bacmid/nsp-6及阳性对照Bacmid/CAT，已构建成功。
2. 昆虫细胞Sf9、High Five及其相关培养基、转染试剂均购自Invitrogen公司。
抗His单克隆抗体购自Oncogene公司，CAT-ELISA试剂盒购自Roche。
实验步骤：一、昆虫细胞转染：1． Sf9细胞计数，取6孔板中的两孔，每孔加入9×10 5个细胞(其中一孔设为正常对照)，并以全培培养至少1小时，使细胞贴壁。
2．准备重组质粒和细胞转染试剂的混合物：a. 溶解1μg纯化重组杆状病毒重组质粒于100μl 无添加成分的Grace’s Medium。
b. 转染试剂充分摇匀后取6μl加入100μl 无添加成分的Grace’s Medium，混匀。
c. 将上述稀释好的质粒及稀释好的转染剂混匀，室温孵育20min。
3．重组质粒与转染剂混合液孵育的同时，以2ml无添加成分的Grace’s Medium洗涤待转染的一孔细胞并弃去洗液。
4．取0.8ml无添加成分的Grace’s Medium加入质粒与转染剂的混合液中，轻轻混匀后，总体积约为1ml。
加入上步洗涤后的细胞孔中，27℃继续培养5h。
5．移除质粒、转染剂混合物，加入2ml全培。
27℃湿盒孵育，直到病变现象产生。
二、病毒贮液的制备：1. 病毒感染晚期（正常24-72h）可见细胞停止生长、黏附，呈颗粒状外观。
即收集含病毒的培养上清，500g离心5min，去除细胞和碎片。
2. 上清即为P1病毒贮液，移入新的离心管中4℃避光保存。
长期保存分装冻存于-80℃。
3. 病毒贮液的扩增，按以下公式进行所需病毒P1贮液的量：感染所需病毒贮液量(ml)=[MOI(pfu/cell) ×细胞数÷病毒贮液效价(pfu/ml)]注：若不进行病毒空斑测定，P1贮液效价按照1×10 6到1×10 7计。
4. 扩增P1液制备P2病毒贮液方法如下：a. 转染当天，取2×106个细胞/孔加入六孔板中，贴壁生长至少1h。
关于生物防治的论文
昆虫杆状病毒的研究与应用现状摘要：杆状病毒是节肢动物的专性病原物，多见于昆虫纲的鳞翅目昆虫。
在昆虫杆状病毒中昆虫杆状病毒表达载体系统的建立和发展，被誉为20世纪80年代真核表达研究领域的一个重大进展。
文章重点介绍了昆虫杆状病毒表达载体系统的研究和在基础研究领域，农、林业的应用现状。
关键词：昆虫杆状病毒表达载体系统，基础研究，农、林业昆虫杆状病毒包含核型多角体病毒和颗粒体病毒两大类，是昆虫专一性病原物，对目标害虫致病性强，不产生抗药性，田间释放安全、环保。
同时由于病毒粒子被抗逆性很强的蛋白（多角体蛋白或颗粒体蛋白）所包裹，在环境中较为稳定，制成农药制剂后，货架寿命相对较长，使用方便，具有很强的商品属性。
其中，昆虫杆状病毒表达载体系统具有表达水平高、表达产物可进行翻译后加工，并可通过感染昆虫幼虫而实现大规模低成本生产基因工程产品。
早在上世纪70年代，昆虫杆状病毒就被美国食品与药品管理局和世界卫生组织推荐为安全的生物杀虫剂用于害虫的防治。
当前，环境保护和食品安全问题日益受到关注，如何解决植物保护和环境污染、农药残留之间的矛盾，是植保工作者必须面对的课题。
昆虫杆状病毒杀虫剂作为生物农药中的重要成员，应该为此做出贡献。
我国昆虫病毒杀虫剂的产业化开发已有30年的历史，有过骄人的成绩，然而同其它产业化成功的生物农药相比（如Bt、井冈霉素、阿维菌素等），无论在生产规模、质量标准、市场份额、社会影响等诸多方面，都存在巨大的差距。
一、昆虫杆状病毒的研究昆虫杆状病毒是最大的环状单一双链DNA病毒，其基因组在90～230 kb之间，具有编码上百种蛋白质的能力。
该病毒基因组可在昆虫细胞核内进行复制和转录，其巨大的DNA复制后组装在杆状的核衣壳内。
由于昆虫杆状病毒DNA具有大量的非复制必需区，能容许基因缺失或替换，且其较大的柔软性，能容纳大片段外源DNA的插入，这为昆虫杆状病毒的重组提供了广阔发展空间。
在昆虫杆状病毒的研究中，杆状病毒表达载体系统是一个以昆虫杆状病毒为外源基因载体，以昆虫和昆虫细胞为受体的表达系统。
对虾杆状病毒病
组织损伤
03
病毒导致对虾的肝胰腺、鳃丝等组织损伤，影响其正常生理功
能。
对虾品种的敏感性差异
敏感性差异
不同品种的对虾对杆状病毒的敏感性存在差异 。
高风险品种
部分品种的对虾容易感染杆状病毒，如白对虾 、斑节对虾等。
低风险品种
部分品种的对虾对杆状病毒相对不敏感，如草虾、沼泽对虾等。
04
病毒的检测和诊断
病毒的分类和特征
分类
SBV属于杆状病毒科，是虾类的专性病毒。
特征
SBV的主要特征是其杆状形态，长度约为750纳米，直径约为110纳米。该病毒 具有囊膜，内含有一个大的、线性的、dsDNA基因组。
病毒的基因组和蛋白质
基因组
SBV的基因组为dsDNA，大小约为80kb，编码约20个蛋白 质。基因组被分成两个主要部分，即大端（L）和小端（S） ，它们分别编码病毒的复制和包装相关蛋白。
针对对虾杆状病毒病的威胁，提出了多种可持续发展 的策略，包括改变养殖模式、优化养殖环境、疫苗研 发和应用等，以保障对虾养殖业的可持续发展。
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对虾杆状病毒病
汇报人：
目录
• 病毒概述 • 病毒的流行病学 • 病毒的致病性和症状 • 病毒的检测和诊断 • 病毒的预防和控制 • 研究进展和未来趋势
01
病毒概述
病毒的发现和命名
发现
对虾杆状病毒病是在1998年首次发现于中国对虾上，后来在其他对虾种类上也 发现了该病毒的存在。
命名
该病毒被命名为对虾杆状病毒（Shrimp Banded Virus，SBV），属于杆状病 毒科。
注意药物的使用方法和剂量，确保药 物的安全和有效性，避免药物残留和 对对虾的影响。
杆状病毒介绍
杆状病毒介绍杆状病毒关键词：昆虫病毒，杆状病毒，核型多角体病毒，颗粒体病毒，质型多角体病毒杆状病毒是一类在自然界中专一性感染节肢动物的DNA病毒，病毒粒子呈杆状，基因组为双链环状DNA分子，DNA以超螺旋形式压缩包装在杆状衣壳内，大小在90～180 Kb之间。
目前杆状病毒作为高效、安全的无公害生物虫剂广泛应用于害虫防治。
杆状病毒只来源于无脊椎动物，虽然已发现600多种杆状病毒，但进行分子生物学研究的不到20种。
杆状病毒的基因组为单一闭合环状双链DNA分子，大小为80～160 kb，其基因组可在昆虫细胞核复制和转录。
DNA 复制后组装在杆状病毒的核衣内，后者具有较大的柔韧性，可容纳较大片段的外源DNA插入，因此是表达大片段DNA的理想载体。
其中，用作外源基因表达载体的杆状病毒，目前仅限于核型多角体病毒(nuclear polyhedrosis virus，NPV)。
该病毒颗粒在细胞内可由多角体蛋白包裹形成长度约1~5 m的包含体病毒，呈多角体形状。
核型多角体病毒有两种形式：一种为包含体病毒(occluded virus，OV)，另一种则为细胞外芽生病毒(budded virus，BV)。
它们在病毒感染中扮演的角色不同，包含体病毒是昆虫间水平感染的病毒形式，昆虫往往是食入污染OV的食物后引起感染。
包含体病毒外层裹了一层蛋白晶体，即为29 000的多角体蛋白，它对病毒的水平感染起以下作用：①保护病毒颗粒在外界传播过程中免遭环境因素的破坏而失活。
②保证病毒颗粒在适当的位置释放，引起感染。
昆虫中肠上皮局部的强碱性环境(pH=10.5)，可使病毒颗粒释放蛋白酶溶解多角体。
BV病毒是个体内细胞间的感染形式，由细胞芽生出BV，进入血淋巴系统中感染其它部位的细胞或直接在临近细胞内感染。
近几十年，有关杆状病毒基因结构、功能和表达调节的研究进展迅速，其中研究最深入的是mùxu苜蓿银蚊夜蛾(autogra—phacalifornica)多核型多角体病毒(multiple nuclear polyhedro-sis virus，MNPV)，简称AcMNPV或AcNPV。
杆状病毒基因转导的技术和应用
杆状病毒基因转导的技术和应用随着科学技术的不断进步，人类对基因的认识和应用也逐渐深入。
在基因工程领域，杆状病毒基因转导技术是一种十分有前途的技术。
本文将介绍杆状病毒的基本情况、杆状病毒基因转导技术的原理和应用。
一、杆状病毒的基本情况杆状病毒是一种单链RNA病毒，是植物病毒中最重要的一种。
它可以侵入植物细胞内部，通过自身的基因组合成一种非常具有活力的蛋白质，然后传递给其他细胞。
由于其生物学特性，许多疾病和社会问题一直没有得到很好的解决。
因此，了解杆状病毒的基本情况是基因转导技术研究的重要前提。
二、杆状病毒基因转导技术的原理杆状病毒基因转导技术是将外源DNA引入植物细胞中的一种方法。
一般来说，它是通过将带有目的基因的载体构建成病毒载体，然后通过感染植物细胞来实现目标基因的转录和翻译的。
在这个过程中，载体的构建是很关键的。
一般来说，载体需要包括一个病毒颗粒功能区、一个基因组合成的目标DNA功能区和一个表达基因的启动子区。
通过这三个功能区的合成，我们就可以得到病毒颗粒，进而实现基因转导。
三、杆状病毒基因转导技术的应用杆状病毒基因转导技术的应用非常广泛，在基因工程、生物学研究和生产过程中都有非常重要的作用。
以下是几个常见的应用领域：1. 植物基因研究杆状病毒基因转导技术可以用于植物基因的研究和功能分析。
通过这种方法，可以快速有效地将外源基因引入植物细胞，研究它们的表达和功能等方面的问题。
这能够提高我们的基因研究的精度和效率，也可以为我们了解植物的种类和特性提供有用的信息。
2. 植物基因工程杆状病毒基因转导技术还可以用于植物的基因工程领域。
通过这种方法，我们可以有效地转化作物和一些经济植物，从而对其进行基因编辑和优化。
这有助于我们提高作物产量、提高经济效益、改善植物的品质，为人们生活和经济发展做出贡献。
3. 疫苗生产杆状病毒基因转导技术也可以用于疫苗的生产。
一些病原体所带有的代谢基因、毒力基因等，可以被杆状病毒转导载体所调控，然后被表达出来。
杆状病毒资料
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杆状病毒：基本概念与深入研究
01
杆状病毒的基本概念及其特征
杆状病毒的分类与分布
杆状病毒属于病毒科
• 包含多个属，如昆虫杆状病毒属、哺乳动物杆状病毒属等 • 病毒分布广泛，包括昆虫、哺乳动物、鸟类等
昆虫杆状病毒属
• 主要感染昆虫，如果蝇、蚊子、蝴蝶等 • 具有宿主特异性，不同病毒针对不同的昆虫宿主
杆状病毒与宿主免疫系统具有相互影响的关系
• 病毒可通过抑制宿主免疫反应，逃避宿主免疫清除 • 宿主免疫系统可通过识别和清除病毒，抑制病毒复制和扩散
04
杆状病毒的应用与研究进展
杆状病毒在基因治疗中的应用
• 杆状病毒可作为基因载体，将目的基因导入宿主细胞 • 病毒具有宿主范围广、基因容量大等优点，适用于多种基因治 疗策略 • 通过基因编辑技术，改造病毒载体，提高基因导入效率和安全 性
哺乳动物杆状病毒属
• 主要感染哺乳动物，如猴子、松鼠、蝙蝠等 • 部分病毒可引起人类疾病，如出血热、脑炎等
杆状病毒的形态与结 构
• 杆状病毒呈长棒状形态，直径约20-30纳米，长度可达几百纳 米
• 病毒核衣壳由核壳蛋白组成，具有螺旋对称结构 • 病毒基因组为单链DNA或双链RNA，线性或环状 • 病毒基因组两端具有反向重复序列（ITR），有助于病毒复制和 组装 • 杆状病毒具有包膜结构，包膜上含有病毒蛋白，有助于病毒感染 宿主细胞
杆状病毒通过吸附、内吞和解包等过程感染宿主细胞
• 病毒吸附在宿主细胞表面，通过受体结合进入细胞 • 病毒通过内吞作用进入细胞，形成内质网或溶酶体内的病毒颗粒 • 病毒在细胞内解包，释放基因组，开始病毒复制和表达
杆状病毒-课件
杆状病毒杀虫剂的研究
杆状病毒杀虫剂作为农作物、森林害虫防治 的新型安全的生物农药，已经得到了人们的重视。 与传统的化学农药相比，杆状病毒对宿主昆虫具 有高度的病原性，对非靶生物十分安全，能够在 环境中长期存活，对人、畜及其他脊椎动物无害， 不污染环境，能和其他化学农药混合使用，同时 具有防效时间长、使用方便等优点，所以早在 1973年就已被联合国粮农组织和世界卫生组织推 荐作为化学农药的理想替代品。
除了和复制相关的基因以外, 在AcMNPV基因组
中共鉴定出10个基因与晚期基因的转录有关,它们是lef4, lef-5, lef-6, lef-8, lef-9, lef-10, lef-11, lef-12, 39K和p47等 基因。其中4个保守基因( lef-4, lef-8, lef-9和p47)的产物
病毒基因表达
早期基因的表达 早期时相向晚期基因表达的过渡 晚期基因的表达
早期基因的表达
早期基因的转录是由宿主RNA聚合酶Ⅱ 介导的。早期基因迅速表达以满足病毒复制 周期所需条件：
控制宿主细胞的代谢机器 为病毒DNA复制提供必需条件 突破或阻断宿主细胞防御机制 提供下一时相病毒基因表达所需基因产物
HaSNPV ）
杆状病毒的分类
Baculoviridae 杆状病毒科
NPV Nucleopholyhedrovirus 核型多角体病毒属
GV Granulovirus 颗粒体病毒属
MNPV SNPV
Baculoviridae
NPV GV
组I 组 II
AcMNPV OpMNPV BmMNPV
LdMNPV SeMNPV HaSNPV
杆状病毒表达系统简介-9页精选文档
体外基因表达系统包括原核细胞系统和真核细胞系统。
原核细胞系统主要是大肠杆菌细胞，它操作简便、周期短收益大及表达产物稳定，但是表达基因的相对分子质量有限，不宜过大，且不能对表达产物进行一些翻译后加工、修饰。
真核细胞系统包括 CHO等哺乳动物细胞、酵母细胞和昆虫细胞等。
昆虫细胞表达系统(即杆状病毒表达系统)具有独特的生物学特性，日益受到人们的重视。
1、杆状病毒的生物学特性杆状病毒只来源于无脊椎动物，虽然已发现600多种杆状病毒，但进行分子生物学研究的不到20种。
杆状病毒的基因组为单一闭合环状双链DNA分子，大小为80～160 kb，其基因组可在昆虫细胞核复制和转录。
DNA复制后组装在杆状病毒的核衣内，后者具有较大的柔韧性，可容纳较大片段的外源DNA插入，因此是表达大片段DNA的理想载体。
其中，用作外源基因表达载体的杆状病毒，目前仅限于核型多角体病毒(nuclear polyhedrosis virus，NPV)。
该病毒颗粒在细胞内可由多角体蛋白包裹形成长度约1~5 m 的包含体病毒，呈多角体形状。
核型多角体病毒有两种形式：一种为包含体病毒(occluded virus，OV)，另一种则为细胞外芽生病毒(budded virus，BV)。
它们在病毒感染中扮演的角色不同，包含体病毒是昆虫间水平感染的病毒形式，昆虫往往是食入污染OV的食物后引起感染。
包含体病毒外层裹了一层蛋白晶体，即为29 000的多角体蛋白，它对病毒的水平感染起以下作用：①保护病毒颗粒在外界传播过程中免遭环境因素的破坏而失活。
②保证病毒颗粒在适当的位置释放，引起感染。
昆虫中肠上皮局部的强碱性环境(pH=10.5)，可使病毒颗粒释放蛋白酶溶解多角体。
BV病毒是个体内细胞间的感染形式，由细胞芽生出BV，进入血淋巴系统中感染其它部位的细胞或直接在临近细胞内感染。
近几十年，有关杆状病毒基因结构、功能和表达调节的研究进展迅速，其中研究最深入的是苜蓿银蚊夜蛾(autogra— phacalifornica)多核型多角体病毒(multiple nuclear polyhedro-sis virus，MNPV)，简称AcMNPV或AcNPV。
杆状病毒表达系统00000001
昆虫杆状病毒系统高效表达重组蛋白●杆状病毒表达系统介绍●杆状病毒蛋白表达系统的优势●杆状病毒表达载体系统（BEVS）●杆状病毒表达宿主细胞●表达优化条件●翻译后修饰对蛋白表达的影响●高通量表达●总结杆状病毒介绍1.杆状病毒是一类具有囊膜包裹的双链环状DNA病毒。
2.杆状病毒在其生命周期中有两种不同的形态：一种为出芽型病毒（budded virus, BV），另一种为包含体病毒（Occlusion‐derived virus, OV）。
3. BV由糖蛋白GP64包裹的单一囊膜蛋白和膜蛋白构成。
4. OV由蛋白结晶基体包裹的多囊膜病毒粒子。
5. 研究最多的杆状病毒株为苜蓿银蚊夜蛾(autogra—phacalifornica)多核型多角体病毒(multiple nuclearpolyhedro‐sis virus，MNPV)，简称AcMNPV或AcNPV。
6. AcMNPV只侵染鳞翅类幼虫。
杆状病毒生命周期●早期（0‐6h PI）•核衣壳迁移到细胞核•病毒DNA释放•开始早期基因表达●晚期（6‐24h PI）•更多DNA复制•新产生的核衣壳离开细胞核，随后在离开细胞质•的过程中得到囊膜蛋白•产生新的出芽病毒●极晚期Courtesy: Dr. Linda Lua, The University of Queensland, Australia •出芽病毒减少•核衣壳在细胞核内得到囊膜蛋白形成MNPVs•MNPVs以多晶体形式出芽，主要是多角体蛋白，形成包含体病毒。
多角体启动子是杆状病毒表达载体系统的主要元件。
优点缺点大肠杆菌成本低、表达量高。
缺乏蛋白质翻译后加工机制；目的蛋白不可溶，蛋白生物活性低。
酵母表达量高，可以翻译后加工，易实现高密度发酵。
蛋白质量不理想。
哺乳动物细胞重组蛋白生物活性高。
成本高；表达水平低，技术和环境要求高。
昆虫细胞重组蛋白生物学活性高；表达水平高；能同时表达多个基因。
重组蛋白糖基化程度低。
昆虫杆状病毒杀虫剂课件
苏云金杆菌复配等。
•昆虫杆状病毒杀虫剂
•17
结语
昆虫杆状病毒杀虫剂具有对人、畜和环境安全，
不易产生抗性等优点，且符合IPM农业可持续发展
的要求。以开发得最为成功的棉铃虫病毒杀虫剂为
例，至今的十几年间，累计生产逾2000t，推广面
积超过66.67万公顷。但是，我国各类生物农药的
个方面：
⑴修饰病毒本身基因以提高杆状病毒的感染力;
⑵在杆状病毒基因组中插入外源基因以增强病
毒毒力（研究较多）;
⑶用异源病毒重组来扩大杆状病毒杀虫谱。
•昆虫杆状病毒杀虫剂
•13
⑴修饰病毒本身基因
•
e.g.缺失egt基因
egt基因是杆状病毒在个体水平调控感染宿主生长发育
的唯一已知基因。缺失egt基因的重组病毒可引起幼虫生长
发育代谢的失调, 加速感染虫体的死亡。
OReily等(1991)发现银纹夜蛾核多角体病毒的一个早期
非必需基因蜕皮甾体尿苷二磷酸葡萄糖转移酶基因, 该基因
受早期启动子控制, 编码的一个506aa蛋白能阻止幼虫蜕皮
和化蛹, 促进病毒自身的增殖。缺失该基因的重组病毒能比
野生型病毒提早27.5h杀死粉纹夜蛾幼虫, 受感染的幼虫取食
量也减少了40% 。
•昆虫杆状病毒杀虫剂
•14
⑵插入外源基因
e.g.插入植物蛋白酶抑制剂基因
植物蛋白酶抑制剂基因编码的植物蛋白酶抑制
因子作为植物抵抗害虫的天然防御体系, 近年来已
引起人们的注意。季平等(1996)把慈姑蛋白酶抑制
剂B基因插入家蚕BmNPV 基因组中, 获得了带慈姑
蛋白酶抑制剂B基因的重组家蚕BmNPV。重组病毒
杆状病毒介绍
杆状病毒关键词：昆虫病毒，杆状病毒，核型多角体病毒，颗粒体病毒，质型多角体病毒杆状病毒是一类在自然界中专一性感染节肢动物的DNA病毒，病毒粒子呈杆状，基因组为双链环状DNA分子，DNA以超螺旋形式压缩包装在杆状衣壳内，大小在90～180 Kb之间。
目前杆状病毒作为高效、安全的无公害生物虫剂广泛应用于害虫防治。
杆状病毒只来源于无脊椎动物，虽然已发现600多种杆状病毒，但进行分子生物学研究的不到20种。
杆状病毒的基因组为单一闭合环状双链DNA 分子，大小为80～160 kb，其基因组可在昆虫细胞核复制和转录。
DNA复制后组装在杆状病毒的核衣内，后者具有较大的柔韧性，可容纳较大片段的外源DNA 插入，因此是表达大片段DNA的理想载体。
其中，用作外源基因表达载体的杆状病毒，目前仅限于核型多角体病毒(nuclear polyhedrosis virus，NPV)。
该病毒颗粒在细胞内可由多角体蛋白包裹形成长度约1~5 m的包含体病毒，呈多角体形状。
核型多角体病毒有两种形式：一种为包含体病毒(occluded virus，OV)，另一种则为细胞外芽生病毒(budded virus，BV)。
它们在病毒感染中扮演的角色不同，包含体病毒是昆虫间水平感染的病毒形式，昆虫往往是食入污染OV的食物后引起感染。
包含体病毒外层裹了一层蛋白晶体，即为29 000的多角体蛋白，它对病毒的水平感染起以下作用：①保护病毒颗粒在外界传播过程中免遭环境因素的破坏而失活。
②保证病毒颗粒在适当的位置释放，引起感染。
昆虫中肠上皮局部的强碱性环境(pH=10.5)，可使病毒颗粒释放蛋白酶溶解多角体。
BV病毒是个体内细胞间的感染形式，由细胞芽生出BV，进入血淋巴系统中感染其它部位的细胞或直接在临近细胞内感染。
近几十年，有关杆状病毒基因结构、功能和表达调节的研究进展迅速，其中研究最深入的是mùxu苜蓿银蚊夜蛾(autogra—phacalifornica)多核型多角体病毒(multiple nuclear polyhedro-sis virus，MNPV)，简称AcMNPV或AcNPV。
杆状病毒表达系统
同源重组：先将外源基因克隆到转移载体上，然后与线性 化Bacmid上共转染转染昆虫细胞，获得重组杆状病毒：
“转座”和“同源重组”目前都在使用中。 “转座”方式的代表是ThermoFisher的Bac-to-Bac系统。 采用“同源重组”方式的有Clontech的BacPAK系统、OET 的FlashBac系统，以及Bacmid Ltd.的qBac系统。 这两种方式与外源基因的表达量无关。
J Virol. 1993 Aug;67(8):4566-79. Luckow VA, Lee SC, Barry GF, Olins PO.
Bacmid polyhedrin位点附近序列细节： 目前使用的Bacmid大都源于这个Bacmid。
获得重组病毒的方式
转座：先将外源基因克隆到转移载体上，然后在大肠杆菌 中通过转座，将外源基因转移到Bacmid上。提取重组 Bacmid，转染昆虫细胞，获得重组杆状病毒：
无论如何，相对于其他表达系统，杆状病毒表达载体系统 （BEVS）是个比较均衡的表达系统：
经过长期优化，杆状病毒表达载体系统的产量已经有了极 大的提高：
目前外源蛋白的生产成本大幅度下降，使杆状病毒表达载 体系统能进. Kaba et al. / Journal of Virological Methods 122 (2004) 113–118
敲除p26,p10,p74极大地提高了外源基因的产量：
Cell Biol Toxicol (2010) 26:57–68
糖基化改造 把昆虫细胞中缺少的糖基化酶克隆到Bacmid上，使蛋白的 糖基化更像哺乳动物细胞：
用重组的质粒和野生型的AcMNPV共同感染Sf细胞。
得到的病毒通过空斑筛选(0.5%)，得到重组病毒。
杆状病毒转移载体是什么？
杆状病毒转移载体是什么？杆状病毒载体系统广泛应用于昆虫细胞中表达重组蛋白，它是真核表达重组蛋白最通用和最强大的系统之一。
该系统特别有利于在真核宿主细胞中大规模制备重组蛋白。
许多真核生物蛋白的翻译后修饰只能在真核细胞中发生（例如糖基化），或者需要真核细胞环境来进行正确折叠（例如膜蛋白质），而原核蛋白表达系统却没有这些功能。
杆状病毒是一种双链DNA病毒，通常会感染昆虫，特别是鳞翅目昆虫（moths, butterflies and skippers）。
克隆载体pBV是经优化的，可与来自AcMNPV（Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus）的穿梭载体（称为Bacmid）一起使用，该穿梭载体的野生型基因组大小为134 kb。
首先将目的基因克隆到含有强启动子的pBV载体上，目的基因表达盒与庆大霉素抗性基因的侧翼序列为Tn7转座子末端元件Tn7L和Tn7R。
然后，将该载体转化到携带Bacmid穿梭载体和辅助质粒的大肠杆菌中。
Bacmid穿梭载体是一个非常大的质粒，含有经修饰后携带lacZ基因的杆状病毒基因组和插入lacZ基因编码区的mini-attTn7位点。
辅助质粒可以表达Tn7转座酶，由转座酶介导pBV载体上Tn7R 和Tn7L的之间的区域转座到mini-attTn7位点，Tn7R和Tn7L的之间的区域是目的基因和庆大霉素抗性基因的表达盒。
通过庆大霉素筛选和蓝/白筛选鉴定出重组的阳性克隆（由于lacZ表达，非重组菌落为蓝色，而由于转座子插入破坏lacZ，重组菌落为白色），纯化的重组Bacmid DNA可用于转染昆虫细胞以产生活的杆状病毒，进而产生目的重组蛋白。
最常用的杆状病毒重组蛋白表达细胞系是Sf9，来源于草地贪夜蛾（fall armyworm）的卵巢组织。
该细胞系适用于各种培养条件，包括悬浮或单细胞培养以及无血清培养基。
幼虫和其他鳞翅目细胞系也被广泛使用，也有一些关于杆状病毒可应用于哺乳动物细胞的报道。
杆状病毒
杆状病毒关键词：昆虫病毒，杆状病毒，核型多角体病毒，颗粒体病毒，质型多角体病毒杆状病毒就是一类在自然界中专一性感染节肢动物得DNA病毒，病毒粒子呈杆状，基因组为双链环状DNA分子，DNA以超螺旋形式压缩包装在杆状衣壳内，大小在90～180 Kb之间。
目前杆状病毒作为高效、安全得无公害生物虫剂广泛应用于害虫防治。
杆状病毒只来源于无脊椎动物，虽然已发现600多种杆状病毒，但进行分子生物学研究得不到20种。
杆状病毒得基因组为单一闭合环状双链DNA 分子，大小为80～160 kb，其基因组可在昆虫细胞核复制与转录。
DNA复制后组装在杆状病毒得核衣内，后者具有较大得柔韧性，可容纳较大片段得外源DNA 插入，因此就是表达大片段DNA得理想载体。
其中，用作外源基因表达载体得杆状病毒，目前仅限于核型多角体病毒(nuclear polyhedrosis virus，NPV)。
该病毒颗粒在细胞内可由多角体蛋白包裹形成长度约1~5 m得包含体病毒，呈多角体形状。
核型多角体病毒有两种形式：一种为包含体病毒(occluded virus，OV)，另一种则为细胞外芽生病毒(budded virus，BV)。
它们在病毒感染中扮演得角色不同，包含体病毒就是昆虫间水平感染得病毒形式，昆虫往往就是食入污染OV得食物后引起感染。
包含体病毒外层裹了一层蛋白晶体，即为29 000得多角体蛋白，它对病毒得水平感染起以下作用：①保护病毒颗粒在外界传播过程中免遭环境因素得破坏而失活。
②保证病毒颗粒在适当得位置释放，引起感染。
昆虫中肠上皮局部得强碱性环境(pH=10、5)，可使病毒颗粒释放蛋白酶溶解多角体。
BV病毒就是个体内细胞间得感染形式，由细胞芽生出BV，进入血淋巴系统中感染其它部位得细胞或直接在临近细胞内感染。
近几十年，有关杆状病毒基因结构、功能与表达调节得研究进展迅速，其中研究最深入得就是mùxu苜蓿银蚊夜蛾(autogra—phacalifornica)多核型多角体病毒(multiple nuclear polyhedro-sis virus，MNPV)，简称AcMNPV或AcNPV。
杆状病毒PPT
20世纪50年代至80年代，杆状病毒研究取得重要进展
• 基因工程技术的应用
• 杆状病毒表达系统的建立
• 杆状病毒疫苗的研究与开发
21世纪以来，杆状病毒研究逐渐成为热点
• 基因编辑技术在杆状病毒研究中的应用
• 杆状病毒作为基因载体的研究
• 杆状病毒与宿主互作机制的研究
杆状病毒在生态系统中的地位
杆状病毒在自然界广泛分布
成分是蛋白质
杆状病毒核衣
壳的蛋白质可
以分为结构蛋
白和非结构蛋
白
杆状病毒基因
组由单股正链
RNA组成
01
02
03
• 蛋白质分子具有二级结构和
• 结构蛋白参与病毒颗粒的组
• RNA分子具有磷酸二酯键
三级结构
装和稳定性
连接
• 蛋白质分子之间通过氢键和
• 非结构蛋白参与病毒的复制
• RNA分子具有鸟嘌呤和胞
范德华力相互作用
和疫苗开发提供新思路
• 通过蛋白质组学技术分析病毒感染的
• 通过蛋白质组学技术筛选病毒感染的
宿主细胞蛋白质表达变化
特异性标志物
• 研究病毒蛋白与宿主蛋白的相互作用
• 利用病毒蛋白开发新型疫苗和抗病毒
和功能
药物
04
杆状病毒的宿主与致病机制
杆状病毒的宿主范围与感染途径
杆状病毒具有较宽的宿主范围
• 主要侵染细菌、真菌和原生动物等微生物
• 免疫治疗：通过免疫调节和免疫干预手段，提高宿主免疫力，抵抗病毒感染
• 杆状病毒防治面临的挑战包括病毒变异、免疫逃避和疫苗研发等方面
• 病毒变异：杆状病毒易发生变异，影响疫苗的免疫效果和防治效果
• 免疫逃避：杆状病毒具有多种免疫逃避策略，降低宿主免疫系统的抵抗力
杆状病毒介绍
杆状病毒介绍杆状病毒关键词：昆虫病毒，杆状病毒，核型多角体病毒，颗粒体病毒，质型多角体病毒杆状病毒是一类在自然界中专一性感染节肢动物的DNA病毒，病毒粒子呈杆状，基因组为双链环状DNA分子，DNA以超螺旋形式压缩包装在杆状衣壳内，大小在90～180 Kb之间。
目前杆状病毒作为高效、安全的无公害生物虫剂广泛应用于害虫防治。
杆状病毒只来源于无脊椎动物，虽然已发现600多种杆状病毒，但进行分子生物学研究的不到20种。
杆状病毒的基因组为单一闭合环状双链DNA分子，大小为80～160 kb，其基因组可在昆虫细胞核复制和转录。
DNA 复制后组装在杆状病毒的核衣内，后者具有较大的柔韧性，可容纳较大片段的外源DNA插入，因此是表达大片段DNA的理想载体。
其中，用作外源基因表达载体的杆状病毒，目前仅限于核型多角体病毒(nuclear polyhedrosis virus，NPV)。
该病毒颗粒在细胞内可由多角体蛋白包裹形成长度约1~5 m的包含体病毒，呈多角体形状。
核型多角体病毒有两种形式：一种为包含体病毒(occluded virus，OV)，另一种则为细胞外芽生病毒(budded virus，BV)。
它们在病毒感染中扮演的角色不同，包含体病毒是昆虫间水平感染的病毒形式，昆虫往往是食入污染OV的食物后引起感染。
包含体病毒外层裹了一层蛋白晶体，即为29 000的多角体蛋白，它对病毒的水平感染起以下作用：①保护病毒颗粒在外界传播过程中免遭环境因素的破坏而失活。
②保证病毒颗粒在适当的位置释放，引起感染。
昆虫中肠上皮局部的强碱性环境(pH=10.5)，可使病毒颗粒释放蛋白酶溶解多角体。
BV病毒是个体内细胞间的感染形式，由细胞芽生出BV，进入血淋巴系统中感染其它部位的细胞或直接在临近细胞内感染。
近几十年，有关杆状病毒基因结构、功能和表达调节的研究进展迅速，其中研究最深入的是mùxu苜蓿银蚊夜蛾(autogra—phacalifornica)多核型多角体病毒(multiple nuclear polyhedro-sis virus，MNPV)，简称AcMNPV或AcNPV。
杆状病毒
杆状病毒多角体病多角体病毒，颗粒体病毒，质型关键词：昆虫病毒，杆状病毒，核型毒病毒粒子呈杆DNA病毒，感染节肢动物得杆状病毒就是一类在自然界中专一性以超螺旋形式压缩包装在杆状衣壳内，大DNA DNA分子，状，基因组为双链环状之间。
目前杆状病毒作为高效、安全得无公害生物虫剂广泛应180 Kb小在90～多种杆状病毒，600 杆状病毒只来源于无脊椎动物，虽然已发现用于害虫防治。
DNA杆状病毒得基因组为单一闭合环状双链但进行分子生物学研究得不到20种。
复制后组DNA，其基因组可在昆虫细胞核复制与转录。
分子，大小为80～160 kbDNA装在杆状病毒得核衣内，后者具有较大得柔韧性，可容纳较大片段得外源用作外源基因表达载体得杆其中，DNA得理想载体。
插入，因此就是表达大片段。
该NPV)(nuclear polyhedrosis virus，状病毒，目前仅限于核型多角体病毒呈多角得包含体病毒，1~5 m病毒颗粒在细胞内可由多角体蛋白包裹形成长度约体形状。
核型多角体病毒有两种形式：，，OV)一种为包含体病毒(occluded virus BV)。
，另一种则为细胞外芽生病毒(budded virus它们在病毒感染中扮演得角色不同，包含体病毒就是昆虫间水平感染得病毒形得食物后引起感染。
包含体病毒外层裹了一层蛋式，昆虫往往就是食入污染OV得多角体蛋白，它对病毒得水平感染起以下作用：①保护白晶体，即为29 000②保证病毒颗粒在适当病毒颗粒在外界传播过程中免遭环境因素得破坏而失活。
，可使病毒、5)得位置释放，引起感染。
昆虫中肠上皮局部得强碱性环境(pH=10病毒就是个体内细胞间得感染形式，由细胞芽颗粒释放蛋白酶溶解多角体。
BV BV，进入血淋巴系统中感染其它部位得细胞或直接在临近细胞内感染。
生出有关杆状病毒基因结构、功能与表达调节得研究进展迅速，其中研究近几十年，最深入得就是苜蓿银蚊夜蛾(autogra—phacalifornica)多核型多角体病xumù毒(multiple nuclear polyhedro-sis virus，MNPV)，简称AcMNPV或AcNPV。
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杆状病毒关键词：昆虫病毒，杆状病毒，核型多角体病毒，颗粒体病毒，质型多角体病毒杆状病毒是一类在自然界中专一性感染节肢动物的DNA病毒，病毒粒子呈杆状，基因组为双链环状DNA分子，DNA以超螺旋形式压缩包装在杆状衣壳内，大小在90～180 Kb之间。
目前杆状病毒作为高效、安全的无公害生物虫剂广泛应用于害虫防治。
杆状病毒只来源于无脊椎动物，虽然已发现600多种杆状病毒，但进行分子生物学研究的不到20种。
杆状病毒的基因组为单一闭合环状双链DNA 分子，大小为80～160 kb，其基因组可在昆虫细胞核复制和转录。
DNA复制后组装在杆状病毒的核衣内，后者具有较大的柔韧性，可容纳较大片段的外源DNA 插入，因此是表达大片段DNA的理想载体。
其中，用作外源基因表达载体的杆状病毒，目前仅限于核型多角体病毒(nuclear polyhedrosis virus，NPV)。
该病毒颗粒在细胞内可由多角体蛋白包裹形成长度约1~5 m的包含体病毒，呈多角体形状。
核型多角体病毒有两种形式：一种为包含体病毒(occluded virus，OV)，另一种则为细胞外芽生病毒(budded virus，BV)。
它们在病毒感染中扮演的角色不同，包含体病毒是昆虫间水平感染的病毒形式，昆虫往往是食入污染OV的食物后引起感染。
包含体病毒外层裹了一层蛋白晶体，即为29 000的多角体蛋白，它对病毒的水平感染起以下作用：①保护病毒颗粒在外界传播过程中免遭环境因素的破坏而失活。
②保证病毒颗粒在适当的位置释放，引起感染。
昆虫中肠上皮局部的强碱性环境(pH=10.5)，可使病毒颗粒释放蛋白酶溶解多角体。
BV病毒是个体内细胞间的感染形式，由细胞芽生出BV，进入血淋巴系统中感染其它部位的细胞或直接在临近细胞内感染。
近几十年，有关杆状病毒基因结构、功能和表达调节的研究进展迅速，其中研究最深入的是mùxu苜蓿银蚊夜蛾(autogra—phacalifornica)多核型多角体病毒(multiple nuclear polyhedro-sis virus，MNPV)，简称AcMNPV或AcNPV。
该病毒是杆状病毒科 Baculoviridae的原型，是一种大的、带外壳的双链DNA病毒，能感染30多种鳞翅目昆虫，被广泛用作基因表达系统载体。
其它作为表达载体的杆状病毒，主要是来自家蚕的NP~(bombyx moil，BmNP~)。
由于家蚕幼虫体内系统适合大规模地制备生产外源蛋白，且成本低，显示出良好的应用前景。
本文主要介绍 AcNPV病毒，BmNPV在许多方面与其具有共同的特征。
AcNPV的基因表达分为4个阶段：立即早期基因表达、早期基因表达、晚期基因表达和极晚期基因表达。
前两个阶段的基因表达早于DNA复制，而后两个阶段的基因表达则伴随着一系列的病毒DNA合成。
其中在极晚期基因表达过程中，有两种高效表达的蛋白，它们是多角体蛋白和P10蛋白：多角体蛋白是形成包含体的主要成分，感染后期在细胞中的积累可高达30％~50％，是病毒复制非必需成分，但对病毒粒子却有保护作用，可使之保持稳定和感染能力另一类高效表达的极晚期蛋白为P10蛋白，也是一类病毒复制非必需成分，可在细胞中形成纤维状物质，可能与细胞溶解有关。
多角体基因和P10基因现在都已被定位和克隆这两个基因的启动子具有较强的启动能力，因此这两个基因位点成为杆状病毒表达载体系统理想的外源基因插入位点。
1.杆状病毒基因组的结构和功能研究杆状病毒基因组为双链环状DNA分子。
DNA以超螺旋方式被压缩包装在杆状核衣壳(rod.shaped nueleocapsid)内，核衣壳包被脂质蛋白囊膜(envelope)后形成病毒粒子。
核衣壳包括衣壳(capsid)蛋白和髓核(COle)。
其中衣壳蛋白是杆状病毒粒子的主要结构蛋白；髓核由病毒DNA分子和与其密切相关的碱性蛋白构成。
碱性蛋白同DNA紧密结合以维持其复杂有序的超螺旋结构。
目前已知基因组全序列的杆状病毒有苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)b]、家蚕核多角体病毒(BmNPV) 、黄杉毒蛾多核衣壳核多角体病毒(OpMNPV)、舞毒蛾多核衣壳核多角体病毒(LdMNPV) 、甜菜夜蛾多核衣壳核多角体病毒(SeMNPV)、棉铃虫核型多角体病毒(HaNPV)，以及斜纹夜蛾核型多角体病毒(SphMNPV)。
目前AcMNPV基因组的研究最为深入，它是双链超螺旋大分子环状DNA，其大小为90～160kb，约编码154个基因。
AcMNPV基因组的基因组织(gene organization)较为复杂，基因组的不同区域具有功能分化，基因的分布尚无规律可循，但AcMNPV基因组含有8个同源区，每区含有不等的重复或倒置重复序列，这些重复序列由位于中间的不完整回文序列及其两侧各约20bp的序列构成。
同源区是杆状病毒基因组普通存在的功能域结构，对于基因表达的调节具有增强作用，同时也是DNA复制的原点。
杆状病毒中现已鉴定的基因近70种，可分为结构蛋白基因和非结构蛋白基因两大类。
结构蛋白基因如polh、P10、gp64、p6.9、gp41、vp39等基因。
非结构基因中，与DNA复制相关的重要基因有helicase基因(he1)、dnapol、lef-1、lef-2、lef-3、ie-1、/ie-2、p35、pe-38等；起表达调节作用的基因主要有ie-1、ie-2、lef类基因、p35、pe38等。
这些代表性基因与其功能的关系见表1。
2．杆状病毒载体表达系统的特点AcNPV病毒用作外源基因的表达载体，通常是通过体内同源重组的方法，用外源基因替代多角体蛋白基因而构建重组病毒。
由于多角体基因启动子在感染后18~24h开始转录和翻译，一直持续到70 h。
外源基因置换掉多角体基因后，并不影响后代病毒的感染与复制，意味着重组病毒不需要辅助病毒的功能。
杆状病毒表达系统自从第一次用来表达干扰素以后在许多重组蛋白的表达中得到广泛应用，例如用于表达白介素(IL)一2，3、BMP及多种病毒蛋白等。
相对其他表达系统它具有以下几个方面的特点：①组蛋白具有完整的生物学功能：杆状病毒表达系统可为高表达的外源蛋白在细胞内进行正确折叠、二硫键的搭配及寡聚物的形成提供良好的环境，可使表达产物在结构及功能上接近天然蛋白。
②②能进行翻译后的加工修饰：杆状病毒表达系统具有对蛋白质完整的翻译后加工能力，包括糖基化、磷酸化、酰基化、信号肽切除及肽段的切割和分解等，修饰的位点与天然蛋白在细胞内的情况完全一致：对比实验证明，在昆虫细胞发生的糖基化位点与哺乳动物细胞中完全一致，但修饰的寡糖种类却不完全一样。
这种不一致对不同目的蛋白的活性影响不同，所以昆虫表达系统还可作为一个研究糖基化对蛋白质结构与功能影响方面的理想模型。
③③表达水平高：与其它真核表达系统相比较，此系统最突出的特点就是能获得重组蛋白高水平的表达，最高可使目的蛋白的量达到细胞总蛋白的50％。
④能容纳大分子的插入片段：杆状病毒毒粒可以扩大，并能包装大的基因片段，但目前尚不知杆状病毒所能容纳的外源基因长度的上限。
④⑤能同时表达多个基因：杆状病毒表达系统具有在同一细胞内同时表达多个基因的能力。
既可采用不同的重组病毒同时感染细胞的形式，也可在同一转移载体上同时克隆两个外源基因，表达产物可加工形成具有活性的异源二聚体或多聚体。
另外，昆虫杆状病毒表达系统具有剪切的功能，能表达基因组DNA；还有对重组蛋白进行定位的功能，如将核蛋白转送到细胞核上，膜蛋白则定位在膜上，分泌蛋白则可分泌到细胞外等。
最后，杆状病毒对脊椎动物无感染性，现有研究也表明其启动子在N-％动物细胞中没有活性，因此在表达癌基因或有潜在毒性的蛋白时可能优于其它系统。
⑤3．杆状病毒载体的重组与筛选杆状病毒由于基因组庞大，外源基因的克隆不能通过酶切连接的方式直接插入，必须通过转移载体的介导．即将极晚期基因(如多角体基因及其边界区)克隆入细菌的质粒中，消除其编码区和不合适的酶切位点，保留其5’端对高效表达必需的调控区，并在其下游引入合适的酶切位点供外源基因的插入，即得到转移载体。
将要表达的外源基因插入其启动子下游，再与野生型AcNPV DNA共转染昆虫细胞，通过两侧同源边界区在体内发生同源重组，使多角体蛋白基因被外源基因取代。
而将外源基因整合到病毒基因组的相应位置，由于多角体基因被破坏，则不能形成多角体。
这种表型在进行常规空斑测定时，可同野生型具有多角体的病毒空斑区别开来，这就是最初的筛选重组病毒的方式。
但由于重组效率较低(0.1％-1％)，表型差别不显著，应用上有一定的困难。
为此，经过不断探索，在重组杆状病毒的筛选与鉴定方面取得了很大改进，具体方法有以下几种。
3.1．半乳糖苷酶的蓝白筛选1990年，Vialard等在多角体基因的上游，利用pl0基因启动子带动LacZ基因构建了转移载体pJVNheI。
将其共转染sf细胞后，重组病毒可表达B-半乳糖苷酶，通过加入x-gal使之形成蓝色空斑，便可进行重组病毒的筛选。
1990年，Kins提出了线形化技术，其原理是线形化的杆状病毒基因组感染性很低，但仍具有与引入细胞内的同源序列进行同源重组的能力。
如果同源序列位于线形化杆状病毒的两端，则基因组即可环化恢复完整的感染性，使阳性重组率大大提高。
蓝白斑筛选蓝白斑筛选是一种基因工程常用的重组菌筛选方法。
野生型大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。
有色物质可以使整个培养菌落产生颜色变化，而颜色变化是鉴定和筛选的最直观有效的方法。
设计适用于蓝白斑筛选的基因工程菌为β-半乳糖苷酶缺陷型菌株。
这种宿主菌的染色体基因组中编码β-半乳糖苷酶的基因突变，造成其编码的β-半乳糖苷酶失去正常N段一个146个氨基酸的短肽（即α肽链），从而不具有生物活性，即无法作用于X-gal产生蓝色物质。
用于蓝白斑筛选的载体具有一段称为lacz'的基因，lacz'中包括：一段β-半乳糖苷酶的启动子；编码α肽链的区段；一个多克隆位点(MCS)。
MCS位于编码α肽链的区段中，是外源DNA的选择性插入位点，但其本身不影响载体编码α肽链的功能活性。
虽然上述缺陷株基因组无法单独编码有活性的β-半乳糖苷酶，但当菌体中含有带lacz'的质粒后，质粒lacz'基因编码的α肽链和菌株基因组表达的Ｎ端缺陷的β-半乳糖苷酶突变体互补，具有与完整β-半乳糖苷酶相同的作用X-gal生成蓝色物质的能力，这种现象即α-互补。
操作中，添加IPTG(异丙基硫代-β-Ｄ-半乳糖苷)以激活lacz'中的β-半乳糖苷酶的启动子，在含有X-gal的固体平板培养基中菌落呈现蓝色。