pH对热处理状态下κ-酪蛋白水解作用和凝乳酶凝胶脱脂乳作用的影响解读

pH对热处理状态下κ-酪蛋白水解作用和凝乳酶

凝胶脱脂乳作用的影响

Effect of pH at heat treatment on the hydrolysis of k-casein and the gelation of skim milk by chymosin

目录

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8牛奶的pH重调，酪蛋白在胶体相和血清相之间的分布

摘要

脱脂牛奶是指牛奶在调整pH值在6.5和7.1之间,在90℃加热30分钟后的牛乳。热处理后,样本再次进行调整到自然pH（pH值为6.67），建立新的平衡。高浓度的变性乳清蛋白与在pH为6.5时加热过程中的酪蛋白胶束有关（约占加热30分钟后总数的70%—80%）。变性乳清蛋白的含量在加热的条件下随pH的升高而降低。所以分别在pH6.7、6.9、7.1加热30分钟后与酪蛋白胶束有关的变性乳清蛋白的含量为30%、20%、10%。在加热时pH的增加使越来越多的酪蛋白转入到血清相中。以κ-酪蛋白的损失和副-κ-酪蛋白的形成时间作为用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测牛奶样本凝乳酶处理的结果。无论pH值在加热或热处理应用中，κ-酪蛋白的损失和副-κ-酪蛋白的形成在常温或加热的样品中相似。检测用凝乳酶作用过的牛奶样品的胶凝化性能随时间的变化表明不管已变性的乳清蛋白是否与酪蛋白微胶粒或牛奶中的血清有关，经过热处理的奶的凝胶化时间显著增加，所形成的凝胶的牢固性显著减小。pH对热处理没有影响。这些结果表明，牛奶的热处理只对凝乳酶反应（酶相）的初级阶段有很小的影响。然而，热处理对本反应的第二阶段有显著影响，不管变性乳清蛋白是否和酪蛋白胶束或牛奶血清中不沉淀的聚集体有关，其效果是类似的。

关键词：牛奶；热处理；pH值；凝乳酶；酪蛋白胶束；凝胶。

1．简介

在牛的酪蛋白胶束中，κ-酪蛋白主要位于二硫键连接的聚合物的胶束表面。疏水的N末端区域与亲水的胶束相关联，带负电荷的C末端区域作为一个高度柔性的纤维在胶束表面突出。

这种结构使酪蛋白胶束的稳定性提高，因为柔性纤维提供了抗聚集的空间位阻和静电稳定。虽然酪蛋白非常稳定，但是他们可以通过某些方法破坏，如酸化至等电点，加入溶剂如乙醇或某些特定酶。

酪蛋白胶束酶的不稳定是奶酪制作过程的基础。传统上所用的酶提取物是凝乳酶，是从年轻的小牛的第四个胃获得，它包含了一些主要控制牛奶凝固的主要凝乳酶（EC3.4.23.4）。凝乳酶添加到牛奶中后发生的反应可被分为不同的步骤或阶段。第一阶段是酶水解κ-酪蛋白的酶促反应，形成二肽作为反应产物。是一种N末端为副-κ-酪蛋白与酪蛋白胶束保持缔合，而C-末端的糖巨肽（GMP），被释放到血清相中的肽。实际上，凝乳酶被酪蛋白胶束表面上的柔性纤维切割，降低了表面电荷作用，去除立体“毛发”层。这导致酪蛋白胶束的不稳定。第二阶段包括胶束聚集，当有足够的κ-酪蛋白被水解并且如果温度和钙离子的活性足够高，这个阶段就会发生。第二阶段导致凝胶的形成。一些报道称在第三阶段将进一步反应,其中步骤包括如脱水收缩作用,非特异性的蛋白水解作用和结构重组的凝胶网络。

牛奶的热处理导致乳清蛋白的变性和变性乳清蛋白与κ-酪蛋白在酪蛋白胶束表面之间的相互作用。这个相互作用涉及变性乳清蛋白（特别是β-乳球蛋白）游离巯基和κ-酪蛋白二硫键之间的巯基二硫键交换反应。κ-酪蛋白的二硫键被发现于副-κ-酪蛋白区域，κ-酪蛋白被凝乳酶水解后，变性乳清蛋白仍与副-κ-酪蛋白维持关系。因此，在制作奶酪之前牛奶的热处理是相当关键的，因为他似乎有可能通过向奶酪凝乳中加入乳清蛋白使产量有大幅度的提升。结果，已经有相当多热处理对牛奶奶酪制作性能影响的研究。

人们普遍认为，牛奶在经过足够高的温度的热处理后使乳清蛋白变性，导致凝乳酶凝固牛奶的时间增加。然而，对于延缓凝固时间的机制却有相矛盾的观点。大多数报告表明，变性乳清蛋白与κ-酪蛋白之间的相互作用抑制凝乳酶对κ-酪蛋白的作用。然而其他报道显示，加热对凝乳酶反应初级阶段的影响可以忽略不计，他已经表明，凝固过程的第二阶段被变性乳清蛋白的存在或由热引起的钙离子活性减少所抑制。最近一份由vasbinder等人的报告比较了几种分析酶促反应产物的方法。这项研究发现，从热处理的牛奶中分离GMP的水平取决于分离GMP的方法。可以得出结论，乳清蛋白的变性对酶的活性影响不大，而释放的GMP （或副-κ-酪蛋白的形成）在加热和常温的牛奶中是相似的。

大多数是研究自然pH下的牛奶进行热处理后对凝乳酶反应的影响。最近的研究表明，在热处理前调整牛奶的pH可以来改变变性乳清蛋白和酪蛋白胶束的反应水平。在低pH（pH约为6.5）下，经过热处理的牛奶中约有70–80%的乳清蛋白和酪蛋白胶束有关。加热之前随牛奶pH的增加，乳清蛋白作为不沉淀聚合物在血清中的水平逐渐升高，因此，在pH值为6.7时，只有约为30%的变性乳清蛋白与酪蛋白胶束相关联。牛奶的pH升高时会使酪蛋白胶束发生pH依赖性解离。当牛奶的pH为6.5被加热时，大约有10-15％的κ-酪蛋白是不沉淀的，并且该水平随pH的增加而增加，因此，在pH为6.7、6.9和7.1时分别有30％，45％和60％是不沉淀的。随着pH的增加到pH大于6.7时，大部分变性乳清蛋白仍在血清中作为不沉淀聚合物存在。通过在加热之前控制乳的pH，有可能产生具有改变成分的酪蛋白胶束，特别是在胶束表面与κ-酪蛋白相关联的乳清蛋白和κ-酪蛋白含量在胶体相和血清相之间的分布。这些变化可能改变与酪蛋白胶束和牛奶的凝胶化特性相关的凝乳酶活性。因此本研究通过检测凝乳酶对κ-酪蛋白的作用检验酪蛋白胶束的pH依赖性，热诱导的改变是否影响凝乳反应的初级阶段，第二阶段则通过检测由凝乳酶处理过的牛奶的流变性能。

2. 材料和方法

2.1 牛奶供应

将经过重组低热量的脱脂奶粉，放入经过反渗透连接过滤穿过Milli-Q装置净化的水中，制成10g/100g的实验脱脂牛奶样品。在进一步处理前，该重组后的脱脂乳样品允许在环境温度（约为20℃）并轻轻搅拌24h的条件下平衡。叠氮钠（0.01克/ 100克）被添加到牛奶作为防腐剂。