第六章_重组基因导入受体细胞

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转化处理过程中，可能感染杂菌，导致假阳性转化 子的出现，因此须设以下几种对照处理：
① DNA对照处理。转化处理液中用0.2ml无菌水代替0.2m1 感受态细胞，检验DNA溶液是否染菌。 ② 感受态细胞对照处理。转化处理液中用0.1ml NTE缓冲液 (500mM NaCl, 10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH8.0)代替 0.1m1DNA溶液，检验感受态细胞是否染菌。 ③ 感受态细胞有效性对照处理。在0.2ml感受态细胞中加入 0.1ml已知容易转化这种感受态细胞的质粒DNA。
完全适用于大多数大肠杆菌菌株，具有简单快速、重复性好的 优点。每微克质粒DNA产生将近107个转化菌落，该效率可满足常
规克隆的需要。该法制备的感受态细胞可贮存于-70 ℃备用。
• 该法重复性好。操作简便快捷，适用于成批制备 感受态细胞。对这种感受态细胞进行转化，每μg 质粒DNA可以获得5×106～2×l07个转化茵落，完 全可以满足质粒的常规克隆的需要。
重组体分子导入受体细胞的途径 将外源重组体分子导入受体细胞的途包括转化、转染、 转导、显微注射、电穿孔等多种方式。这些途径将随载 体种类和受体系统的不同而异。转化和转导主要适应于 细菌一类的原核细胞和酵母这样的低等真核细胞，而显 微注射和电穿孔主要应用于高等动植物的真核细胞。
把带有目的基因的重组质粒DNA引入受体细胞的过程称为转化 （transformation）。
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关于细菌的感受态本质与存在
• 局部原生质体化假说——细菌表面的细胞壁结构发生变化， 即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA分子能通过 质膜进入细胞。
• 酶受体假说——感受态细胞表面形成一种能接受DNA的酶 切位点，使DNA分子能进入细胞。 通常制备高效转化的感受态细胞的方法是：在冰浴中，用 一定浓度的CaCl2处理对数生长期的细菌。 CaCl2处理后的细菌一般4℃可保存48h,用于转化，大多数 能在1-2天内具有吸收外源DNA的能力。
转化的办法：
用氯化钙制备新鲜的感受态细胞转化法
用复合剂制备感受态细胞
高压电穿孔转化法
三亲本杂交接合转化大肠杆菌
• 大肠杆菌是一种革兰氏阴性菌，自然条件下很难 进行转化，其主要原因是转化因子的吸收较为困 难。在基因工程研究和应用中，转化受体菌细胞 的是根据人们需要构建的外源重组质粒DNA分子， 而非来自供体菌的游离DNA片段(转化因子)。 • 因此在大肠杆菌的转化实验中，很少采取自然转 化的方法，通常的做法是首先采用人工的方法制 备感受态细胞，然后进行转化处理，其中代表性 的方法之一是Ca2+诱导的大肠杆菌转化法。
Ca2+诱导的大肠杆菌转化法
• Ca2+诱导DNA对大肠杆菌细胞的转化的可能原因：
①在0° C的CaCl2低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀，同时 CaCl2使细胞膜磷脂层形成液晶结构，促使细胞外膜与内 膜间隙中的部分核酸酶解离开来，诱导大肠杆菌形成感 受态。 ②Ca2+能与加入的DNA分子结合，形成抗DNA酶(DNase) 的羟基-磷酸钙复合物，并黏附在细菌细胞膜的外表面上。 当42℃热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜的液晶结构 发生剧烈扰动，并随之出现许多间隙，为DNA分子提供 了进入细胞的通道。
用复合剂制备感受态细胞
菌株暴露于组合的二价阳离子（MnCl2和CaCl2）
中更长时间，并且用氯化六氨合高钴、DMSO、DTT
（二硫苏糖醇）等复合试剂处理细菌以提高转化效
率。高于5×108个转化菌落。
• Mg2+对DNA分子有很大的稳定性作用，因此利用 MgCl2与CaCl2共同处理大肠杆菌细胞，可以提高 DNA的转化效率。如利用二甲基亚砜(DMSO)和 二硫苏糖醇(DDT)等进一步处理细胞，能诱导高 频感受态细胞的形成，转化效率可提高100～1000 倍，且对大小质粒分子均可进行有效的转化。 • 但该法要求条件高，对外界污染物极为敏感，通 常很少采用。
五、动物受体细胞
– 优点：
1. 能识别和除去外源真核基因中的内含子，剪切和加工成 熟的mRNA。 2. 真核基因的表达蛋白在翻译后能被正确加工或修饰，产 物具有较好的蛋白质免疫原性，约为酵母细胞的16～20 倍。 3. 易被重组DNA质粒转染，具有遗传稳定性和可重复性。 4. 经转化的动物细胞可将表达产物分泌到培养基中，便于 提纯和加工，成本低。
转化：重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进入受体细 胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程称之为转化。转 化现象最早是由Griffith于1928年在肺炎双球菌中发现的。
• 细菌转化的本质是受体菌直接吸收来自供 体菌的游离DNA片段，即转化因子，并在 细胞中通过遗传交换将之组合到自身的基 因组中，从而获得供体菌的相应遗传性状 的过程。
– 基因组为原核型，除了裸露的染色体DNA外，不含叶绿体DNA 和线粒体DNA，遗传背景简单，便于基因操作和外源DNA的检 测。 – 细胞壁属G-，主要由肽聚糖组成，便于外源DNA的转化。 – 营光合自养生长，培养条件简单，只需光、CO2、无机盐、水和 适宜的温度就能满足生长需要。 – 多种蓝藻含内源质粒，为构建蓝藻质粒载体提供了极好的条件。 – 蓝藻富含蛋白质，并且多数蓝藻无毒，早已用作食物或保健品， 在此基础上采用转基因技术，把一些重要药物的基因转入无毒 蓝藻，就可达到锦上添花的效果。
第五章 重组基因导入受体细胞
第一节 受体细胞
受体细胞(receptor cell)
又称为宿主细胞或寄主细胞(host cell)等，从实 验技术上讲是能摄取外源DNA并使其稳定维持 的细胞；从实验目的上讲是有应用价值和理论 研究价值的细胞。
作为基因工程的宿主细胞必须具Байду номын сангаас以下特性：
① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ ⑧ 便于重组DNA分子的导入； 能使重组DNA分子稳定存在于细胞中； 便于重组体的筛选； 遗传性稳定高，易于扩大培养或发酵生长； 安全性高，无致病性，不会对外界环境造成生物 污染； 有利于外源基因蛋白表达产物在细胞内的积累， 或促进外源基因的高效分泌表达。 在遗传密码的应用上无明显偏倚性； 具有较好的翻译后加工机制，便于真核目的基因 的高效表达； 在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。
至今被用作受体菌的原核生物有大肠杆菌、 枯草杆菌、蓝细菌等。
(一) 大肠杆菌受体细胞
• 大肠杆菌属革兰氏阴性菌，它是目前为止研究得最为 详尽、应用最为广泛的原核生物种类之一，也是基因 工程研究和应用中发展最为完善和成熟的载体受体系 统。 • 优点：繁殖迅速、培养简便，代谢易于控制。 • 缺点：大肠杆菌细胞间隙中含有大量的内毒素，可导 致人体热原反应。
基因工程中常用的受体细胞类型：
• 原核生物细胞 • 真核生物细胞
– 真菌细胞 – 植物细胞 – 动物细胞
一、原核生物细胞
优点：
1. 大部分原核生物细胞无纤维素组成的坚硬细胞壁，便 于外源DNA的进入。 2. 没有核膜，染色体DNA没有固定结合的蛋白质，为外 源DNA与裸露的染色体DNA重组减少了麻烦。 3. 原核生物多为单细胞生物，容易获得一致性的实验材 料，并且培养简单，繁殖迅速，实验周期短，重复实 验快。 4. 基因组小，遗传背景简单，并且不含线粒体和叶绿体 基因组，便于对引入的外源基因进行遗传分析。
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(三) 蓝细菌（蓝藻）
• 蓝藻——又称蓝绿藻或蓝细菌，它含有叶绿素a(缺乏叶 绿素b)和藻胆素，具有光合系统Ⅰ (PS Ⅰ) 和光合系统Ⅱ (PS Ⅱ)、能进行光合作用，但它又具有细菌的特征，无 细胞核及双层膜结构的细胞器，染色体裸露，是一种典 型的原核生物。 • 蓝藻作为表达外源基因的受体菌兼具微生物和植物的优 点，具体表现在：
– 缺点：组织培养技术要求高，难度较大。
– 目前用作基因转移的受体动物主要有猪，羊、牛、鱼等经济 动物和鼠、猴等实验动物，主要用途在于大规模表达生产天 然状态的复杂蛋白质或动物疫苗、动物品种的遗传改良及人 类疾病的基因治疗等。
第二节 重组DNA分子转入受体细胞
一、重组基因导入原核受体细胞
(一)转化
二、丝状真菌受体细胞
霉菌的基因结构、表达调控机理，以及蛋白质 加工与分泌都具有真核生物的特征，利用其表达 高等动植物基因具有原核生物细胞无法比拟的优 点。 霉菌培养条件简单，可以大规模培养； 霉菌可以分泌表达目的基因产物，大大简化目 标产物的分离纯化过程。
三、酵母菌细胞
• 是单细胞真核微生物，外源真核基因理想的表达 系统。 • 优点： 1. 酵母菌是结构最为简单的真核生物之一，其基 因表达调控机理比较清楚，遗传操作相对比较 简单。 2. 具有真核生物蛋白翻译后修饰加工系统。 3. 不含有特异性病毒，不产生毒素。 4. 培养简单，利于大规模发酵生产，成本低廉。 5. 能使外源基因表达产物分泌至培养基中，便于 产物的提取和加工。
DNA分子进入大肠杆菌受体细胞的机制
• 一般认为只有双链闭环或开环的质粒DNA分子才能 转化，而线形DNA分子不能获得转化子。因此，环 状DNA分子中混杂线形DNA分子，会影响环状DNA 分子的转化效率。 • 也有人认为吸附在受体细胞表面上的是双链DNA， 但却以单链DNA进入细胞，这与革兰氏阳性菌的转 化过程相似。
缺点：
1. 原核生物细胞不具备真核生物的蛋白质折叠复性系统， 即使真核生物基因能得到表达，得到的多是无特异性空 间结构的多肽链。 2. 原核生物细胞缺乏真核生物的蛋白质加工系统，而许多 真核生物蛋白质的生物活性正是依赖于其侧链的糖基化 或磷酸化等修饰作用。 3. 原核细胞内源性蛋白酶易降解异源蛋白，造成表达产物 不稳定。
(二)枯草杆菌受体细胞
• • 枯草杆菌又称枯草芽孢杆菌，是一类革兰氏阳性菌。 优点： 1. 枯草杆菌具有胞外酶分泌－调节基因，能将具有表 达的产物高效分泌到培养基中，大大简化了蛋白表 达产物的提取和加工处理等，而且在大多数情况下， 真核生物的异源重组蛋白经枯草杆菌分泌后便具有 天然的构象和生物活性。 2. 枯草杆菌不产生内毒素，无致病性，是一种安全的 基因工程菌。 3. 枯草杆菌具有芽孢形成的能力，易于保存和培养。 4. 枯草杆菌也具有大肠杆菌生长迅速、代谢易于调控、 分子遗传学背景清楚等优点。 应用：已成功的用于表达人的β干扰素、白细胞介素、 乙型肝炎病毒核心抗原和动物口蹄疫病毒VPI抗原等。
用氯化钙制备新鲜的感受态细胞转化法
细菌在低温下经CaCl2溶液处理，细菌细胞膨胀成球形，提高了 膜的通透性，转化混合物中的DNA，形成抗DNase的羧基-钙磷酸 复合物，粘附于细胞表面上，经42℃短时间热冲击处理，会使受
体细菌中诱导产生出一种短暂的感受态。在此期间它们能够摄取
各种不同来源的DNA，如λ噬菌体DNA或质粒DNA等。
四、植物受体细胞
– 优点：全能性，即一个分离的活细胞在合适的培 养条件下，较容易再分化成植株，这意味着一个 获得外源基因的体细胞可以培养出能稳定遗传的 植株或品系。 – 缺点：植物细胞有纤维素参与组成的坚硬细胞壁， 不利于摄取重组DNA分子。 – 现在用作转基因受体的植物有水稻、棉花、玉米、 马铃薯、烟草等经济作物和拟南芥等模式植物。
将重组噬菌体DNA直接引入受体细胞的过程称为转染 （transfection）。 若重组噬菌体DNA被包装到噬菌体头部成为有感染力的噬菌体颗 粒，再以此噬菌体为运载体，将头部重组DNA导入受体细胞中， 这一过程称为转导（transduction）。
转化反应
DNA分子转化的过程如下： 1.吸附——完整的双链DNA分子吸附在受体菌的表面； 2.转化——双链DNA分子解链，单链DNA进入受体菌，另一链降解； 3.自稳——外源质粒DNA分子在细胞内又复制成双链环状DNA； 4.表达——供体基因随同复制子同时复制，并被转录、翻译。 有的实验结果表明，进行转化的是双链DNA，有的则证明吸附在 细胞表面的是双链DNA,但是以单链DNA进入细胞。 至于质粒DNA转化质粒构型的关系，认为只有闭环DNA与开环DNA 的转化，才能获得转化子，而线性质粒DNA进行转化不能得到转 化子，因为用超螺旋闭合环状和开环质粒转化大肠杆菌不会受 到菌体酶的破坏。