三种中草药中皂苷类化合物的液质联用分析

三种中草药中皂苷类化合物的液质联用分析本课题从六个方面阐述了皂苷类药物有效成分的药理作用,评述了目前皂苷类有效成分的提取分离技术,指出了不同提取方法的优缺点,综述了皂苷类有效成分的分析研究现状,比较了不同检测方法的特点,指出了目前检测方法的不足。针对目前皂苷类药物有效成分的检测现状,依据皂苷类药物有效成分的结构特征,本课题集高效能、高分辨的高效液相色谱分离技术与高灵敏度、高选择性的质谱检测技术于一体,建立了三种中草药中皂苷类化合物的高效液相色谱-电喷雾电离-质谱联用(HPLC-ESI-MS/MS)分析方法,该法灵敏度高,选择性好,可用于皂苷类中草药的有效质量监控。

本课题详细考察了三种中草药中皂苷类化合物的色谱分离及质谱分析检测的最佳条件。通过对固定相、流动相、柱温和流速的研究,优化了色谱分离条件。

通过对离子化模式、喷雾针电压、干燥气温度、干燥气压力、毛细管电压和碰撞能量的研究,得到了最佳的质谱条件最终建立的相应皂苷类化合物分离分析方法如下：(1)柴胡皂苷的研究。目的：建立高效液相色谱-电喷雾离子-质谱联用技术同时测定柴胡中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的新方法。

方法：实验采用Ultimate(?)XB-C8色谱柱(150mm×2.1mm,3μm),流动相：0.1%甲酸水溶液-CH3CN,梯度洗脱；流速：0.2mL·min-1;柱温：35℃；质谱条件为：电喷雾电离源(ESI)；负离子扫描；选择性反应监测(SRM)模式；喷雾针电压：-4500V；干燥气温度：350℃；干燥气压力：22psi；碰撞气(Ar)压力：1.8mT。结果：在最佳实验条件下,柴胡皂苷a和d达到了基线分离。

在负离子模式下,根据化合物准分子离子峰和碎片离子峰,鉴定了化合物的结构。其中,准分子离子峰均为[M-H]=m/z=779,定量离子峰均为

[M-H-Glc]-m/z=617,在最佳实验条件下柴胡皂苷a和d分别在0.05～5.0mg·L-1和0.05～10.0mg·L-1范围内,峰面积与浓度呈现良好的线性关系,柴胡皂苷a

和d的回归方程和相关系数分别为：A=1.31×105c-3.9×104,r=0.9994； A=1.34×105c1.9×104,r=0.9992,检出限分别为15ngⅡm-1(a)和12ngⅡmL-1(d),加标回收率分别为99.3%和99.8%。

结论：该法操作简便、选择性强、灵敏度高,可用于柴胡药材及制剂中柴胡皂苷类化合物的质量控制。(2)知母皂苷的研究。

目的：建立高效液相色谱-电喷雾离子-质谱联用技术同时检测知母中知母皂苷AⅢ和知母皂苷BⅡ两种活性成分的新方法。方法：实验采用Ultimate(?)XB-C8色谱柱(150mm×2.1mm,3μm),流动相：0.05%甲酸水溶液-CH3CN,梯度洗脱,流速：0.2mL·min-1,柱温：35℃；质谱条件：电喷雾电离源(ESI)；负离子扫描；多反应监测模式(MRM)；喷雾针电压：-5000V；干燥气温度：350℃；干燥气压力：25psi；碰撞气(Ar)压力：1.8mT。

结果：在最佳实验条件下,知母皂苷AⅢ和BⅡ达到了基线分离。在负离子模式下根据化合物准分子离子峰和碎片离子峰,鉴定了化合物的结构。

其中,准分子离子峰依次为[M-H]-m/z=739(AⅢ)和[M-H]-m/z=919(BⅡ),碎片离子峰依次为[M-H-Glc]-m/z=577(AⅢ)(?)[M-H-Glc]-m/z=757(BⅡ).在最佳实验条件下,知母皂苷AⅢ在0.01～10.0mg.L-1范围内,峰面积与浓度呈现良好的线性关系,回归方程和相关系数分别为：A=2.01×107c+2.0×106,r=0.9996,检出限为6ng·mL-1,加标回收率为99.2%。知母皂苷BⅡ在0.01～10.0mg·L-1范围内,峰面积与浓度呈现良好的线性关系,回归方程和相关系数分别为：A=6.03×106C+3.4×105,r=0.9993,检出限为2ng·mL-1,加标回收率为98.9%。

结论：该法操作简便,选择性强、灵敏度高,可用于知母药材及制剂中知母皂苷类化合物的质量监控。(3)黄芪皂苷的研究。

目的：建立高效液相色谱-电喷雾离子-质谱联技术同时检测黄芪中黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ和黄芪皂苷Ⅳ三种活性化合物的新方法。方法：实验采用Ultimate(?) XB-C8色谱柱(150mm×2.1mm,3μm),流动相：0.5%甲酸水溶液

-CH3CN,梯度洗脱；流速：0.2mL·min-1;柱温：35℃；质谱条件：电喷雾电离源(ESI)；负离子扫描；多反应监测模式(MRM)和选择离子监测模式(SIM)并用；喷雾针电压：-5000V；干燥气温度：320℃；干燥气压力：25psi；碰撞气(Ar)压力：1.8mT。

结果：在最佳实验条件下,黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ和黄芪皂苷Ⅳ实现了基线分离。在负离子模式下根据化合物准分子离子峰和碎片离子峰,鉴定了化合物的结构。

其中,准分子离子峰依次为[M+HCOO]-m/z=913(I),[M+HCOO]-m/z=871(II)和[M+HCOO]-m/z=829(Ⅳ)。碎片离子峰依次为

[M-H]-m/z=867(Ⅰ),[M-H]-m/z=825(Ⅱ)和[M-H]-m/z=783(Ⅳ).在最佳实验条件下,黄芪皂苷Ⅰ在0.01-30.0mg·L-1范围内,峰面积与浓度呈现良好的线性关系,回归方程和相关系数分别为：A=1.04×105c+3.1×104,r=0.9969,检出限为

3ng·mL-1,加标回收率为99.2%。

黄芪皂苷Ⅱ和Ⅳ均在0.01～10.0mg·L-1范围内,峰面积与浓度呈现良好的线性关系,回归方程和相关系数分别为：A=1.71×105c-2.1×

104,r=0.9996;A=3.81×105c1.9×103, r=0.9999.检出限分别为4ng·mL-1和3ng·mL-1,加标回收率分别为100.7%和100.2%。结论：该法操作简便、选择性