mark--145细胞培养 的相关知识
细胞培养实验基础知识和相关无菌操作流程
细胞培养实验基础知识和相关无菌操作流程1.原代培养(primary culture)直接从有机体中取出的细胞、组织或器官开始进行体外培养直到第一次传代为止。
这种培养称之为原代培养。
2.传代培养(subculture)细胞从一个培养皿以1:2或1:2以上的比率转移或移植到另一个器皿的培养,这种培养称之为传代培养。
3.悬浮培养(suspension culture)细胞培养的一种类型。
培养时通过一特殊的装臵,使细胞瓶按一定的速度不断地转动,使细胞始终处于悬浮状态中进行增殖。
4.克隆(clone)克隆指的是从一个细胞靠有丝分裂获得的一个细胞群体(population)。
5.细胞系(cell line)在第二届细胞和组织培养专题讨论会上提出细胞系的概念为“原代培养物经首次传代成功后即成为细胞系,由原先存在于原代培养物中的细胞世系(lineages of cells)所组成。
如果不能继续传代或传代数有限,可称有限细胞系(finite cell line),如果可以连续传代,则可称为连续细胞系(continous cell line)。
以前认为细胞系来自细胞发生了遗传突变,并带有癌变的特点,这种细胞有可能在培养条件下无限的传下去。
这种细胞的特点是染色体为异倍体,丧失了正常细胞的“接触抑制”的特性。
6.细胞株(cell strain)细胞株的概念如下:由原代培养中,用选择或克隆代,选出具有特征标记的细胞,经传代形成细胞株,这些特性或标记在以后的培养中必须保持下去。
以前认为经体外传代培养后细胞不表现退化现象,大约可传50代以上者,其染色体维持二倍体不变,保留正常细胞的“接触抑制”等特性。
一常用设备一准备室的设备:双蒸馏水蒸馏器、酸缸、烤箱、高压锅、储品柜(放臵未消毒物品)、储品柜(放臵消毒过的物品)、包装台。
配液室的设备:扭力天平和电子天平(称量药品)、PH计(测量培养用液PH值)、磁力搅拌器(配臵溶液室搅拌溶液)。
细胞培养技术总结
细胞的生长特点
体外培养的细胞，按其生长方式可分为贴壁型和 悬浮型。 贴壁细胞的主要代表是成纤维细胞，一般在接种 后24h内贴壁，刚开始时细胞多呈圆形，随贴 壁时间延长，逐渐伸展成梭形或多边形。传代 后的成纤维细胞12h开始贴壁，24h内完全贴壁。 上皮细胞型、游走细胞型和多形型都属于贴壁 型细胞。 悬浮型细胞包括血液白细胞和癌肿瘤细胞，不需 要附着于底物而于悬浮状态下生长良好。
四、细胞的冻存与复苏
• 细胞冻存和复苏的基本原则：慢冻快融， 可以最大限度的保存细胞活力。 • 目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作 保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的 通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分 渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从 而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。 • 冻存的细胞浓度：正常人的成纤维细胞浓 度： 5×106~1×107细胞/ml
细胞生长的三个阶段
• 潜伏期 ：细胞接种后先悬浮在培养液中，此时细胞 质回缩，胞体呈圆球形，继续培养便开始贴壁， 24h内便可长满瓶壁。 • 对数生长期 ：细胞增殖最旺盛的时期，随细胞数量 不断增多，生长空间逐渐减少，最后细胞互相接触 汇成一片。 • 停滞期：细胞数量达到饱和密度之后，停止增殖， 细胞数量不再增加，但仍有代谢活动，因而培养液 中的营养逐渐耗尽，代谢产物积累，此时需要分离 培养即传代，否则细胞会中毒，发生形态改变或者 脱落死亡，故传代应在细胞长满瓶壁80%的时候传 代最好。
注：细胞培养液要贮存在4℃冰箱，避免光照， 试验前放入37℃水浴中温热。
加血清的高糖培养液存放期为六个月，期间 谷氨酰胺会分解，若细胞生长不佳，可以 再添加适量谷氨酰胺。 环境条件：95%空气和5%CO2 的气体； 温度：37℃
三、细胞的消化传代
成纤维细胞生长至高密度时，须分殖至新的培养瓶中， 一般稀释比例为1:3 至1:6。 1.PBS缓冲液、0.25%的胰蛋白酶和含10%的DMEM预先 放入37℃水浴中温热； 2.倒掉培养瓶内旧的培养液，加入4~6ml PBS缓冲液洗 涤残留培养液； 3.加入2~3ml胰蛋白酶，放入37℃ CO2孵箱中消化2~3 分钟，镜检观察，如有细胞间隙变大，细胞质回缩 现象，加入培养液终止消化。 4.用吸管轻轻吹打瓶壁，使细胞脱落制成悬液，加入 离心管中，800rpm离心5min； 5.倾去上清液，加少量培养液重悬细胞，计数后调整 细胞浓度为1×107 /ml，在新的或者灭菌好的培养瓶 加入6ml左右新鲜培养液，将调整好浓度的细胞液 滴入培养瓶中，混匀，做好标记，放入37℃ CO2孵 箱培养。隔天换液。
常见细胞系细胞培养基应用选择及相关细胞培养资料
常见细胞系细胞培养基应用选择选择培养基没有一定的标准，有几点建议可供参考：(1 ）建立某种细胞株所用的培养基应该是培养这种细胞首选的培养基。
可以查阅参考文献，或在购买细胞株时咨询。
(2) 其它实验室惯用的培养基不妨一试，许多培养基可以适合多种细胞。
(3) 根据细胞株的特点、实验的需要来选择培养基。
如小鼠细胞株多选RPMI1640 。
(4) 用多种培养基培养目的细胞，观察其生长状态，可以用生长曲线、集落形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳培养基，这是最客观的方法，但比较繁琐。
细胞系细胞类型种组织培养基293 成纤维细胞人胚胎肾MEM, 10% 热灭活马血清IMR-90 成纤维细胞人肺MEM, 10% 胎牛血清和NEAAW1-38 成纤维细胞人胚胎肺,3月妊MEM, 10% 胎牛血清娠A549 上皮细胞人肺癌F-12K, 10%胎牛血清A431 上皮型人表皮细胞癌DMEM, 10% 胎牛血清BHL-100 上皮细胞人乳房McCoy'5A, 10% 胎牛血清BeWo 上皮滋养层人绒毛癌F-12K, 15%胎牛血清Caco-2 上皮细胞人结肠腺癌MEM, 10% 胎牛血清和NEAAChang 上皮细胞人肝脏BME, 10% 小牛血清HCT-15 上皮细胞人结肠直肠腺癌 RPMI-1640, 10% 胎牛血清HeLa 上皮细胞人子宫颈癌MEM, 10% 胎牛血清和NEAA(in suspension,S-MEM)HEp-G2 上皮细胞人肝细胞癌MEM, 10% 胎牛血清和NEAAHEp-2 上皮细胞人喉癌MEM, 10% 胎牛血清;或RPMI-1640, 10% 胎牛血清HT-1080 上皮细胞人纤维肉瘤MEM, 10% HI 胎牛血清和NEAAHT-29 上皮细胞人结肠腺癌McCoy'5A, 10% 胎牛血清JEG-2 上皮细胞人绒毛膜癌MEM, 10% 胎牛血清MCF7 上皮细胞人乳腺癌MEM, 10% 胎牛血清NEAA, 10ug/ml 胰岛素KB 上皮细胞人口腔癌MEM, 10% 胎牛血清和NEAASaos-2 上皮细胞人骨肉瘤McCoy'5A, 15% 胎牛血清WI-38 上皮细胞人胚胎肺BME, 10% 胎牛血清WISH 上皮细胞人羊膜BME, 10% 胎牛血清WS1 人胚胎皮肤MEM, 10% 胎牛血清和NEAAHUVEC 内皮细胞人脐带F-12K, 10% 胎牛血清和肝素盐100 ug/mlEB-3 淋巴样人Burkitt淋巴瘤 RPMI-1640, 10% 胎牛血清Raji 淋巴样人Burkitt淋巴瘤 RPMI-1640, 10% 胎牛血清IM-9 成淋巴细胞人骨髓瘤病人骨髓RPMI-1640, 10% 胎牛血清Daudi 成淋巴细胞人淋巴瘤病人血液RPMI-1640, 10% 胎牛血清H9 成淋巴细胞人T细胞淋巴瘤 RPMI-1640, 20% 胎牛血清HL-60 成淋巴细胞人早幼粒细胞白血病RPMI-1640, 20% 胎牛血清Jurkat 成淋巴细胞人T细胞白血病 RPMI-1640, 10% 胎牛血清K-562 成淋巴细胞人骨髓性的白血病RPMI-1640, 10% 胎牛血清U937 淋巴样人组织细胞淋巴瘤RPMI-1640, 10% 胎牛血清KG-1 骨髓白细胞人红白血病病人骨髓IMDM, 20% 胎牛血清McCoy 成纤维细胞小鼠未知MEM, 10% 胎牛血清BALB/3T3 成纤维细胞小鼠胚胎DMEM, 10% 胎牛血清3T6 成纤维细胞小鼠胚胎DMEM, 10% 胎牛血清A9 成纤维细胞小鼠结缔组织DMEM+10% 胎牛血清+6-硫鸟嘌呤（30μg/ml）+2,6-二氨基嘌呤（30μg/ml）AtT-20 上皮细胞小鼠垂体肿瘤F-10, 15% 马血清和2.5% 胎牛血清Clone M-3 上皮细胞小鼠黑素瘤F-10, 15% 马血清和2.5% 胎牛血清I-10 上皮细胞小鼠睾丸癌F-10, 15% 马血清和2.5% 胎牛血清Y-1 上皮细胞小鼠肾上腺瘤F-10, 15% 马血清和2.5% 胎牛血清12WEHI-3b 类巨噬细胞 小鼠 骨髓单核细胞白血病DMEM, 10% 胎牛血清ES-D3 胚胎型 小鼠 多能胚胎干细胞DMEM+ 15% 胎牛血清+100μmol/L 2-巯基丙醇F9 胚胎型至内胚层小鼠 睾丸畸胎癌 DMEM, 15% 胎牛血清 BHK-21 成纤维细胞 仓鼠 肾GMEM, 10% 胎牛血清 或MEM, 10% 胎牛血清 和NEAAHaK 上皮细胞 仓鼠 肾 BME, 10% 小牛血清 CHO-K1 上皮细胞 仓鼠 卵巢 F-12, 10%胎牛血清 AR42J . 大鼠 胰腺肿瘤 Ham'sF-12K, 20%胎牛血清 BRL3A . 大鼠 肝 Coon'sF-12K, 5%胎牛血清 Clone 9 上皮细胞 大鼠 肝脏 F-12K, 10%胎牛血清 H4--Ⅱ-E-C3 上皮样 大鼠 肝癌 F-12K, 10%胎牛血清` GH1 上皮细胞 大鼠 垂体肿瘤 F-10, 15% 马血清和2.5% 胎牛血清 GH3 上皮细胞 大鼠 垂体肿瘤 F-10, 15% 马血清和2.5% 胎牛血清 IEC-6 上皮样 大鼠 正常小肠 DMEM, 5% 胎牛血清,胰岛素0.1μg/ml L2 上皮细胞 大鼠 肺 F-12K, 10%胎牛血清 XC 上皮细胞 大鼠 肉瘤 MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA LLC-WRC 256 上皮细胞 大鼠 癌 199培养基, 5% 马血清 Jensen 成纤维细胞 大鼠 肉瘤 McCoy's 5A, 5% 胎牛血清Rat2(TK-) 成纤维细胞样 大鼠 Rat2(TK-)克隆衍生 DMEM, 5% 胎牛血清,30μg/ml BrdU PC12 NGF 诱导的神经表型细胞大鼠 肾上腺嗜铬细胞 RPMI-1640, 10% 胎牛血清L6 大鼠 大鼠 骨骼肌成肌细胞DMEM, 10% 胎牛血清D-17 上皮细胞 狗 骨肉瘤 MEM, 10% 胎牛血清 和 NEAA BT 成纤维细胞 牛 鼻甲骨细胞 MEM, 10% 胎牛血清 和 NEAA MARC-145 猴 猴肾 MEM 或DMEM, 10%小牛血清 CV-1 成纤维细胞 猴 非洲绿猴肾 MEM, 10% 胎牛血清 COS-1 成纤维细胞 猴 肾 MEM, 10% 胎牛血清 COS-3 成纤维细胞 猴 肾 MEM, 10% 胎牛血清 COS-7 成纤维细胞 猴 非洲绿猴肾 MEM, 10% 胎牛血清 Vero 成纤维细胞 猴 非洲绿猴肾 199培养基，5% 胎牛血清 B95-8 成淋样 绒猴 EB 病毒感染的白血病细胞RPMI-1640, 10% 胎牛血清CRFK 上皮细胞 猫 肾 MEM, 10% 胎牛血清 和 NEAA常用显色剂产品中文名 产品英文名 分子式 分子量别名 备注 酸性铬兰K Acid Chrome blue K C16H9N2Na3O12S3 586.40 邻氨基酚一对一磺酸钠偶氮-1,8-二羟基萘-3,6-二磺酸钠 酸性铬深蓝 Acid Chrome dark blue C16H10N2Na2O9S2 484.36 2-(2-羟基苯偶氮)-1,8-二羟基萘-3,6-二磺酸钠酸性品红 Acid fuchsin C20H17N3Na2O9S3 585.55酸性复红 吖啶橙 Acridine Orange C17H20ClN3·ZnCl2 盐酸3，6-双（二甲氨基）吖啶；碱性橙吖啶黄Acridineyellow C15H15N3HCl 273.76氮蒽黄；绿光碱性黄；2,6-二氨基-2.7-二甲基吖啶盐酸盐阿尔新蓝Alcian Blue8GX C36H88Cl4CuN16S41298.88阿尔新蓝8GX；阿利新蓝8GS；Alcianblue ICI；Nitional fastblue BXM阿尔新绿2GX AlcianGreen 2GX纱染绿2；Ingraingreen 2茜素Alizarin C14H8O4 240.211,2-二羟基蒽醌；1,2-DihydroxyanthraquinonepH5.8(黄)～7.2(紫)茜素络合指示剂Alizarincomplexone C19H15NO8385.333-氨基甲基茜素-N,N-二乙酸；氟试剂，Alizarin Fluorineblue茜素红S Alizarin redS C14H7NaO7S·H2O 360.27茜素磺酸钠；Soliumalizarin sulphonatepH4.3(黄)～6.3(红)茜素紫AlizarinvioletC20H12O7 364.31焦性没食子酚酞；Pyrogallolphthalein;GalleinpH3.8(棕黄)～6.6(玫红)碱兰6B Alkali blue6B C37H34N4O4S 626.71碱性兰6B;Alkalinesky blue鸡冠花红Amaranth C20H11N2Na3O10S3604.46苋菜红；对磺基萘偶氮－R－盐；蓝光酸性红；Naphthol red S氨基黑10B Amidoblack10BC22H14N6Na2O9S2 616.494-萘胺黑10B;Naphthaleneblack 10B苯胺兰(醇溶) Aniline bluealcholsolubleC32H28CIN3，C37H30CIN3490.02，552.09酒精兰；Spirit blue;Opal blue; Light blue苯胺兰（水溶）Aniline bluewatersolubleC32H25N3Na2O9S3 737.72可溶性蓝苯胺黄Anilineyellow C12H11N3 197.24ρ-Aminoazobenzene；对氨基偶氮苯偶氮洋红B AzocarmineBC28H17N3Na2O9S3 681.63偶氮胭脂红B；偶氮红B Rosinduline 2B偶氮洋红G AzocarmineGC28H18ClN3Na2O6S2638.02玫红对氮蒽；偶氮胭脂红G；偶氮洋红GX；Rosazine偶氮荧光桃红Azophloxine C18H13N3Na2O8S2 509.42偶氮焰红；酸性大红；酸性红Acetylred；Amidonaphtholred G；AzogeramineBS金胺O Auramine O C17H22CIN3 308.82 碱性槐黄；Canary yellow；奥黄；金丝雀黄天青ⅠAzure ⅠC14H14ClN3S 291.79 亚甲天青Ⅰ；3-Amino-7-dimethyla minophenazathionium chloride;蔚蓝Ⅰ天青ⅡAzure Ⅱ蔚蓝Ⅱ苯红紫4B Benzopurpurine 4BC34H26N6Na2O6S2 724.71Direct red 4B;Sultan4B; Fast scarlet; 苯并红紫4B3猩红（水溶性）Biebrichscarlet(watersoluble)C22H14N4Na2O7S2 556.47比布列西猩红（水溶性）；猩红B俾士麦粽R Bismarckbrown R C21H26Cl2N8461.39俾士麦粽R；Vesuvine;Bismarckbrown 53俾士麦粽Y Bismarckbrown Y C18H18N8·2HCl419.32Vesuvine;Bismarckbrown G玫瑰桃红R Bordeaux R C20H12N2Na2O7S2 502.42酸性枣红；萘偶氮R盐亮黄Brightyellow C26H18N4Na2O8S2 624.55直接黄4；灿烂黄；二苯乙烯-2,2’-二磺酸钠-4,4’-双(1-偶氮)4-羟基苯；Brilliant yellow灿烂甲酚蓝BrilliantCresyl blue C17H21ClN4O332.83亮甲苯酚蓝；煌焦油蓝；cresyl blue；Brilliant blue灿烂丽春红5R Brilliantponceau 5RC20H11N2Na3O10S3604.44-磺基-1-萘偶氮-2’-萘酚－6’，8’－二磺酸三钠盐溴酚兰Bromophenol blue C19H10Br4O5S 669.96四溴苯酚磺酞pH3.0(黄)～4.6(紫)溴酚红Bromophenol redC19H12Br2O5S 512.17二溴苯酚磺酞；DibromophenolsulphophthaleinpH5.2(黄)～7.0(红)溴氯酚兰Bromochlorophenol blue C19H10Br2Cl2O5S 581.06二溴二氯苯酚磺酞pH3.2(黄)～4.8(紫)溴邻苯三酚红Bromopyrogallal redC19H10Br2O8S·H2O576.17二溴邻苯三酚磺酞；溴焦性没食子酸红；Dibromopyrogallolsulfonphthalein溴百里香酚兰Bromothymol Blue C27H28Br2O5S624.38溴麝香草酚蓝；3,3”-二溴麝香草酚磺酜酞pH6.0(黄)~7.6(兰)钙黄绿素Calcein C30H26N2O13 622.55 3,3’-双（甲胺二乙酸）－荧光素钙羧酸指示剂Calcon-carboxylic acid C21H14N2O7S438.41钙红指示剂；2-羟基-(2-羟基-4-磺基-1-萘基偶氮)-3-萘甲酸；Cal-red indicator胭脂红酸Carminicacid C22H20O13 492.4胭脂虫酸邻苯二酚紫Catecholviolet C19H14O7S386.38二茶酚紫；邻苯二酚磺酞；Pyrocatecholsulphophthalein天青石蓝B Celestin blueBC17H18ClN3O4 363.8天青石蓝；媒染蓝14；Coreine 2R邻甲酚酞Cresolphthalein C22H18O4 346.383,3’-二甲酚酞；邻甲酚酜酞；3,3’-DimethylphenolphthaleinpH8.2(无)~9.8(红)氯酚兰Chlorophenol blueC19H10Cl4O5S 492.273’,3”,5’,5”-四氯酚磺酜酞pH3.0(黄)～4.6(兰)，pH5.8(黄)～7.7(紫)氯酚红Chlorophenol red C19H12Cl2O5S 423.27二氯酚磺酞；3’，3”－DichlorophenylsulphonphthaleinpH4.8(黄)～6.4(紫红)4变色酸Chromotropic acid C16H9N3Na2O10S2 320.291，8-二羟基萘-3，6-二磺酸变色酸2R Chromotrope 2RC16H10N2Na2O8S2 468.39铬变素2R；变色素2R；酸性焰红；Fastfuchsin G黄叱精Y ChrysoidineYC12H12N4HCl 248.72金黄；菊橙柯衣定；2.4-二氨基偶氮苯盐酸盐；2.4-Diamino-azobenzene hydrochloride刚果红Congo Red C32H22N6Na2O6S2 696.68 直接刚果红；刚果红AT；Congo red B,C甲酚固紫Cresyl fastvioletC19H18ClN3O 338.51甲苯酚紫；甲酚青莲；甲酚紫；灿烂甲酚紫；BrilliantCresyl violet；Cresylfast violet B；Cresylviolet结晶紫CrystalvioletC25H30ClN3·9H2O 570.11甲基青莲；甲紫；龙胆紫；甲基紫Methylviolet 6B,10BpH2.0(兰)～5.0(绿)二溴荧光黄DibromofluoresceinC20H10Br2O5 490.14,5二溴荧光素4.5-二氯荧光素4.5-Dichlorofluorescein C20H10Cl2O5401.24.5-二氯荧光黄；4.5-二氯-3.6-荧烷二醇十一甲川蓝色素3.3’Diethyl-9.11.15.17-dineopenty-lenethiocarbocyanine iodineC39H15IN2S2 732.813.3’-二乙基-9.11.15.17-二新戊基间硫氮碳蓝色素碘1.4-二羟基蒽醌1.4-DihydroxyanthraquinoneC14H8O4 240.221.4-蒽醌二酚；1.4-二羟基-9.10-蒽醌二碘荧光素DiiodofluoresceinC20H10I2O5 584.11藻红Y;4,5-二碘荧光黄；Erythrosin yellow;二甲基黄Dimethylyellow C14H15N3 225.29对二甲氨基偶氮苯pH2.9(红)～4.0(黄)2,4-二硝基-1-萘酚-7-磺酸钠2,4-Dinitro-1-naphthol-7-sulfonicacid sodiumsaltC10H4N2Na2O8S 358.19萘酚黄S；Naphtholyellow S; Citronin A;Sulfer yellow S曙红Eosin C20H6Br4Na2O5 691.86 四溴荧光黄；曙红Y （水溶性）；四溴荧光素二钠；Tetrabromofluorescei n disodium salt曙红B Eosin B C20H6Br2N2Na2O9 624.26 兰光曙红；伊红B；Eosin bluish曙红亚甲基兰ⅡEosinmethyleneblue II迈格林华色素；MayGrunwald stain曙红Y(醇溶) Eosin YalcoholsolubleC20H8Br4O5 647.88四溴荧光素；Tetrabromofluorescein；伊红y醇溶性曙红Y(水溶) Eosin YwatersolubleC20H6Br4Na2O5 691.86四溴荧光素二钠；朝红；四溴荧光黄；伊红Y水溶性56铬黑T Eriochrome black T C20H12N3NaO7S 461.38 依来铬黑T ；Solochrome black T 依来铬红B Eriochrome red B C20H15N4NaO5S 446.28 酸性铬红；Omega chrome red B;Salicine bordesux R 乙基曙红Ethyl eosinC22H11Br4KO5713.98四溴荧光素乙酯钾盐；2’,4’,5’,7’-Tetrabrom ofluorescein ethyl ester乙基橙 Ethyl orange C16H18N3NaO3S 355.40 Diethylamnino-azo-b enzene sulfonic acid sodium salt pH3.0(红)～4.5(橙黄)乙基红 Ethyl red C17H19N3O2 297.36 Diethyl red pH4.6(红)～6.6(黄) 乙基紫 Ethyl violet C31H42CIN3 492.15 Ethy purple 6B; hexaethylpararosanili ne hydrochloride 伊文思兰 Evans blue C34H24N6Na4O14S 4 960.8 偶氮蓝T-1824 坚牢蓝B Fast blue B固蓝 B固红TR 重氮盐 Fast Red TR diazosalt C17H13ClN2O6S2 440.87 固红TR 盐； Fast Red TR salt固红VRFast Red VRC20H12N2Na2O7S2502.42坚牢红；1-萘基偶氮-2-萘酚-4.6-二磺酸二钠盐；Chromotrop F4B; Carmoisine BL荧光素钠Fluorescein disodium salt C20H10Na2O5 376.28 荧光黄钠；荧光橙红钠；Uranine;Resorcinol phthalein碱性品红 Fuchsin basic C19H18ClN3，C20H20ClN3 323.82，337.84 盐基品红；Basic magenta没食子兰 Gallocyanin eC15H12N2O5 300.27 没食子酸噁嗪兰；花青；Alizarin blue RBN龙胆紫 Gentian violet C25H30ClN3 408.00 Methyl violet; Aniline violet吉氏色素 Giemsa’s stain姬姆氏色素 苏木精 Hematoxylin C16H14O6·3H2O 365.33 苏木素；苏木色素 肼黄 Hydrazine yellow C16H9N4Na3O9S2534.36 酒石黄；他特嗪；Tatrazine; Tartar yellow靛兰胭脂红 Indigo carmineC16H8N2Na2O8S2 460 可溶性靛；靛红；酸性靛兰；靛兰二磺酸钠碘绿 Iodine Green C27H35Cl2N3 472.52 Heptamethylrosanilin e chloride ；Night green健那绿B Janus green BC30H31ClN6 511.09 双氮嗪绿；詹姆斯绿；Dazine green 健那绿B Janus green BC30H31ClN6 511.09 双氮嗪绿；詹姆斯绿；Dazine green 罗克沙尔坚牢蓝Luxol fast blue blue MBS罗克沙尔固蓝；溶剂蓝李斯曼色素Leishman’SstainEosin methylene bluecompound镁试剂I Magneson I C12H9N3O4 259.22对硝基苯偶氮间苯二酚；4－（4－Nitrophenylazo）-resorcinol镁试剂ⅡMagneson II C16H11N3O3 293.28 对硝基苯偶氮－1－萘酚；4－（4－Nitrophenylazo）-1-naphthol孔雀石绿Malachitegreen C22H25ClN2 364.92品绿；苯胺绿；亮绿；固绿Aniline green间甲酚紫m-Cresolpurpl C21H18O5S 382.44间甲酚磺酞；m-CresolsulphonphthaleinpH1.2(红)~2.8(黄)；pH7.4(黄)~9.0(紫)皂黄Metanilyellow C18H14N3NaO3S 375.38酸性间胺黄、金莲橙G，Tropaeolin GpH1.2(红)～2.3(黄)甲基蓝Methyl blue C37H27N3Na2O9S3 799.8亚甲蓝；次甲蓝；美蓝Helvetia blue;Brilliant cotton blue次甲基兰MethyleneblueC16H18CIN3S·3H2O373.9亚甲基兰；品兰；Swiss blue;Methylthionine chloride甲基绿MethylgreenC26H33Cl2N3 458.48Double green SF;Heptamethyl-prosaniline chloride甲基橙Methylorange C14H14N3NaO3S 327.33金莲橙D；对二甲氨基偶苯磺酸钠；Tropaeolin DpH3.0(红)～4.4(黄)间甲基红m-Methylred C15H15N3O2 269.3对二甲氨基苯偶氮间苯甲酸pH2.0(红)~4.0(黄)甲基红百里香酚兰Methyl redthymol blue甲基红麝香草酚蓝pH4.0(红)～10.0(兰)甲基百里香酚兰络合剂Methylthymol bluecomplexoneC37H44N2O13S 756.83甲基麝香草酚兰络合剂pH6.5(黄)～8.5(浅兰) 10.5～11.6(灰)～12.7(深兰)紫脲酸胺Murexide C8H8N6O6 284.19红紫酸胺；Amnomiumpurpurate;5,5’-Nitrilodibarbituric acidammonium salt萘酚AS醋酸酯Naphthol ASacetateC19H15NO3 305.333-乙酰氧基-2-萘甲酰替苯胺；3-Acetoxy-2-naphthanilide甲萘酚酜酞1-NaphthophthaleinC28H18O4 418.45α-Naphtholphthalein pH7.0(橙红)～8.7(兰绿)萘红Naphthyl red C16H13N3 247.34-苯基偶氮-1-萘胺；BAN；4-Benzeneazo-1-naphthylamine中性红Neutral red C15H16N4·HCl 288.78 3-氨基－6－二甲氨基－2－甲基吩嗪盐酸盐；Toluylene red7耐尔蓝A Nile blue A C40H40N6O6S 732.87硫酸耐尔蓝；硫酸尼罗蓝；碱性蓝12；耐尔蓝BX；Basic blue12；Nile blue BX硝氮黄Nitrazineyellow C16H8N4Na2O11S2 542.36硝基偶氮黄；硝嗪黄；2.4－二硝基苯偶氮－1－萘酚－3，6－二磺酸钠pH6.0(黄)～7.0(兰)1-亚硝基-2-萘酚1-Nitroso-2-naphtholC10H7NO2 173.17钴试剂2-亚硝基-1-萘酚2-Nitroso-1-naphtholC10H7NO2 173.17亚硝基红盐Nitroso-R-salt C10H5NNa2O8S2377.25亚硝基-R-盐；1-亚硝基-2-萘酚-3.6-二磺酸钠核固红Nuclear fastred(Kernechtrot) C6H4COC6(OH)2(SO3Na)(NH2)CO357.28细胞核坚牢红；钙红邻甲酚酞络合剂o-Cresolphthalexon C32H30N2Na2O12680.62酞紫；Phthaleinpurple甲酚红o-Cresol red C21H18O5S 382.43 邻甲酚磺酞，o-CresolsulphonphthaleinpH2.0(红)～3.0(琥珀)，pH7.2(黄)～8.8(紫红)金橙G Orange G C16H10N2Na2O7S2 452.37 橙黄G；耐光橙G；Acidorange；Fast light orange G橙黄ⅠOrange I C16H11N2NaO4S 350.32 金橙Ⅰ；1-Naphthol orange；Tropaeolin G橙黄ⅡOrange ⅡC16H11N2NaO4S·5H2O 440.4金橙Ⅱ；β－Naphtholorange；Acid orange橙黄ⅣOrange ⅣC18H14KN3NaO3S 391.48 金橙Ⅳ；酸性黄D；Diphenylaminoorange；pH1.4(红)～3.2(黄)地衣红Orcein 俄西印；苔红素副品红Pararosanaline C19H19N3O 305.38副玫瑰红；副蔷薇苯胺；对品红五号专利兰Patent blueVC54H61CaN4O14S4 1159.41酸性湖兰；Disulphineblue V; Pontacylbrilliant blue V对二甲氨基亚苄基罗丹宁p-DimethylaminobenzalrhodanineC12H12N2O5S 264.36玫瑰红银试剂；对二甲氨基亚苄基玫瑰红酚酞Phenolphthalein C20H14O4 318.33酚酜；3，3-双（对羟基苯基）苯酞还原酚酜PhenolphthaleinreducedC20H16O4 320.33酚酞啉；Phenolphthalin;Phethalin;DecolorizedPheno lphthalein酚红钠Phenol redsodium C19H13NaO5S 376.36苯酚磺钛钠酚藏花红PhenosafranineC18H15ClN4 322.5 3.7-Diamino-5-phenylphenazinium chloride;酚蕃红花红五甲氧基红Pentamethoxy red C24H26O6410.472,2’,2’’,4,4’-五甲氧基代三苯甲醇pH1.2(紫)~3.2(无)89 丽春红2R Ponceau 2R C18H14N2Na2O7S2 480.43 丽春红G ；酸性大红G ；酸性猩红；Xylidine ponceau 丽春红S 纳盐Ponceau S sodium salt C22H12N4Na4O13S 4 760.58普鲁士蓝 Prussian blue中国兰；亚铁氰化铁 吡罗红BPyronine BC21H27ClN2O358.91 二苯氧杂芑胺B ；哌罗宁B ；焦宁B Tetraethyldiaminoxan thenyl chloride对二甲酚兰 p-Xylenol Blue C23H22O5S410.49 对二甲苯酚磺酰酞；p-Xylenolsulfonephthalein pH1.2(红)～2.8(黄)，pH8.0(黄)～9.6(兰) 喹哪啶红 Quinaldine redC21H23IN2 430.33 2-(对二甲氨基苯乙烯）碘化乙基喹啉 pH1.2(无)~3.0(红) 间苯二酚兰Resorcinol blueC18H15NO8 373.32 树脂酚兰；类石蕊；LacmoidpH4.4(红)～6.2(兰) 罗丹宁 Rhodanine C3H3NOS2 133.18 银试剂，2-硫代-4-噻唑烷酮若丹明 B Rhodamine BC28H31ClN2O3 479.02 玫瑰红B ；四乙基若丹明罗丹明6G Rhodamine 6G C28H31ClN2O3 479.02 玫瑰红6G ；Rhodyle 4G; Calcozine red 6G extra玫瑰红酸 Rosolic acid C19H14O3 290.32 玫红酸；树脂质酸；金红；Aurine;Corallin 番红花红T Safranine T C20H19ClN4 350.85 藏红T ；藏花红T ；盐基桃红；沙黄；Catton red 半二甲酚橙 Semixylenol orange C24H23NNa2O9S 547.52 半二甲酚桔黄 苏旦SudanC12H10N2O2214.22 苯偶氮间苯二酚；Benzen-azo-resorcino l ； 苏旦橙G ； 2,4 Dihydoxyazobenzene苏旦Ⅰ Sudan I C16H12N2O 248.28 苯偶氮-2-萘酚；苏旦黄；Benzene-azo-naphtho l苏旦Ⅱ Sudan II C18H16N2O 276.34 2,4－二甲基苯偶氮－2－萘酚；苏旦红；油溶猩红B苏旦Ⅲ Sudan Ⅲ C22H16N4O 352.40 苯偶氮偶氮-2-萘酚；油红；苏旦红；苏旦G苏旦Ⅳ Sudan Ⅳ C24H20N4O 380.45 邻甲苯偶氮邻甲苯偶氮-2-萘酚；猩红；四号苏旦红油红O Sudan red 5BC26H24N4O 408.50 脂肪红5B ；Fat red 5B ；Solvent red 27 苏旦黑B Sudan black BC29H24N6 456.56 油溶黑BT ；Oil black BT四碘荧光素钠Tetraiodoflu orescein sodium saltC20H6I4Na2O5879.87藻红B 钠盐；赤藓红；Iodeosine四氯四碘荧光素钠TetrachlorotetraiodofluoresceindisodiumsaltC20H2CI4Na2O5 1017.64虎红钠盐；孟加拉玫瑰红B；Rose bengalsodium salt四氯四溴荧光素钠Tetrachlorotetrabromofluororesceinsodium saltC20H2Br4Cl4Na2O5892.64荧光桃红B；焰火B；石南红；Eosin 10B硫堇Thionine C12H10ClN3S 263.75 劳氏青莲；Lauth’s violet百里香酚Thymol C10H14O 150.21百里酚；麝香草酚百里香酚蓝Thymol blue C27H30O5S 466.6麝香草酚兰;Thymolsulbonp hthaleinpH1.2(红)~2.8(黄);pH8.0(黄)~9.6(兰)百里香酚酞络合剂Thymolphthalexon C38H42N2Na2O12764.86麝香草酚酞络合剂；Thymolphthalein-3,3'bis(methyliminodiacetic acid sodium salt)百里香酚酞Thymolphthalein C28H20O4430.55麝香草酚酞；麝香草酚酜，5,5’-Diisopropyl-2’,2”-dimethylphenolphothaleinpH9.0(无)~10.2(兰)达旦黄Titan yellow C28H19N5Na2O6S4 695.73 钛黄；噻唑黄；Claytonyellow;ThiazolyellowpH11.0(黄)～13.0(红)甲苯胺兰O Toluidineblue OC15H16ClN3S 305.82Methylene blueT50(Toxra);Dimethyltoluthionine chioride曲利本兰Trypan blue C34H24N6Na4O14S4690.8锥兰；台盼蓝Benzamine blue;Diamino blue3B;Naphthylamineblue维多利亚兰B Vctoria blueB C33H32ClN3506.1盐基品兰；胜利兰；Corn blue BN;Fastblue二甲酚橙Xylenolorange C31H28N2Na4O13S 760.65二甲酚桔黄；邻甲酚磺酞－3，3’－双（甲基亚胺二乙酸）细胞培养基础篇-实验用品1. 种类︰1.1. 细胞培养实验用品均为无菌，除了玻璃容器与pasteur pipet 外，其它均为塑料无菌制品。
mkn45细胞培养注意事项
mkn45细胞培养注意事项
细胞培养是生物学研究中非常重要的技术之一，以下是关于
mkn45细胞培养的注意事项：
1. 无菌操作，细胞培养需要在无菌条件下进行，以防止细菌、
真菌或其他微生物的污染。
在进行培养前，需要对培养皿、培养液、培养室等进行严格的消毒处理。
2. 细胞培养液配制，对于mkn45细胞的培养液配制，需要根据
细胞的生长特性和营养需求来选择适当的培养基，通常是含有营养
物质和生长因子的培养基。
同时，需要注意培养液的pH值、渗透压
等参数的调节。
3. 培养条件，mkn45细胞的培养需要在适当的温度、湿度和气
体条件下进行。
一般来说，细胞培养室需要保持在37摄氏度、5%二
氧化碳的条件下进行培养。
4. 细胞密度控制，在细胞培养过程中，需要控制细胞的密度，
避免细胞过度密集或者过度稀疏。
通常可以通过显微镜观察细胞的
密度，并根据需要进行细胞的传代或分裂。
5. 污染检测，定期对培养的细胞进行细菌、真菌等微生物污染
的检测，以确保细胞培养的纯度和质量。
6. 操作规范，在进行细胞培养时，需要严格按照操作规程进行，避免操作失误或者交叉污染。
同时，需要注意个人防护，避免对细
胞培养的影响。
总之，mkn45细胞培养需要严格遵守无菌操作、培养液配制、
培养条件、细胞密度控制、污染检测和操作规范等注意事项，以确
保细胞培养的成功和细胞的健康生长。
希望以上回答能够帮助到你。
实验室细胞培养基本知识ppt课件
• 引进的培养物（如购买的细胞系）是高危污染源，要先经过检 疫，并坚持用不含抗生素的培养基培养直至证明没有污染。
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细胞培养箱的无菌
• 培养箱是主要的污染源，应每学期做彻底清洁（箱体、架子、 隔板、托盘），可用70%酒精充分擦拭，并完全挥发晾干。
薄膜。另外，经常还会发现培养基的 pH 值突然降低。在低倍显微镜下可见，
细菌为细胞之间移动的微小颗粒，在高倍显微镜下观察可以分辨出各个细菌的
形状，有球状、杆状和螺旋状等。图为被大肠杆菌污染的293细胞
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酵母：培养物被酵母污染后 也会变得浑浊， 但pH 值变化 极小，污染严重时 pH 值才会 升高。在显微镜下，酵母呈 单个卵圆形或球形颗粒，有 些会芽生出较小的颗粒。图 为293细胞被酵母污染。
• 热稳定的物品（玻璃器皿、金属）用干热灭菌：160℃， 1h；
• 热稳定的液体：水、盐溶液和适度热稳定的塑料制品：硅 树 脂 、 尼 龙 、 聚 丙 烯 、 聚 碳 酸 酯 用 湿 热 灭 菌 ： 121 ℃ ， 20min；
• 不耐热液体：过滤除菌； • 不耐热物品：射线灭菌30min，70%乙醇擦拭。
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细胞培养中的无菌操作
• 加盖：所有试剂瓶子要用深螺旋的聚丙烯盖子，使用时要将盖 子口朝下放置在工作区域，不用时要及时盖好，但可以不用旋 紧。
• 灼烧：开放工作台才需要灼烧，细胞培养用的洁净台中不需要 也不建议灼烧、明火既破坏了层流又难以除去生物危害物质， 还带来了火灾隐患，明火带来的高温还会影响HEPA过滤的寿命。
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无菌操作技术
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无菌操作技术
mark--145细胞培养 的相关知识
一．Marc-145细胞培养1.细胞消化传代Marc-145细胞培养48-72小时后，将细胞用0.2%的胰酶消化后以1：3的比例传代。
细胞培养液（6%小牛血清、1%双抗、93%DMEM培养液），细胞维持液（3%小牛血清、1%双抗、96%DMEM培养液）。
2.细胞冻存（15ml中号培养瓶）将细胞形态较好，细胞活力旺盛（即传代后36-48小时细胞长成单层面）用0.2%的胰酶消化后加入细胞冻存液20ml（30%小牛血清、10%二甲基亚砜DMSO、60%DMEM 培养液），混匀后2ml/管分装，放入细胞冻存盒置-70℃冰箱72小时后放入液氮罐保存。
3.细胞复苏将液氮罐中的细胞快速取出，置37℃温水中解冻，再将解冻后的细胞1000转离心5分钟，在无菌操作台内小心倒掉上清，加入1ml细胞培养液后吹打混匀，吸入到5ml细胞培养瓶内，在加入5ml细胞培养液。
marc 145细胞培养的简单综述2008-07-25 00:00 来源：丁香园点击次数：1930 关键词：marc 145细胞细胞培养综述分享到：收藏夹腾讯微博新浪微博开心网Marc 145细胞培养和维持有关资料综述一、细胞及培养1、Marc145细胞上皮样细胞，来源于猴肾细胞，从母细胞（MA 104细胞）克隆而得到，可连续培养。
2、生长培养基DMEM（高糖型，含4500mg/L D－葡萄糖、L-谷氨酰胺，和110mg/L丙酮酸钠，不含碳酸氢钠）＋5－10％新生牛血清+ 1%双抗（青霉素和链霉素）的培养液。
3、冻存液生长培养基＋10% DMSO4、细胞健康生长的几项注意事项（1）细胞没有支原体等外源因子的感染。
（2）培养液的pH值可在7.0－7.3，以7.2为佳。
（3）一般按1：3传代，细胞接种密度为1－1.5×105cells/ml，48hr后长成单层。
（4）培养基和血清的质量可靠、稳定；建议采用特级小牛血清。
（5）细胞及时传代，不可以在老化后传代，一般在刚长成细胞单层时进行传代、扩增。
Marc 145细胞培养和维持有关资料综述
Marc 145细胞培养和维持有关资料综述北京清大天一生物技术有限公司一、细胞及培养1．Marc145细胞上皮样细胞，来源于猴肾细胞，从母细胞（MA 104细胞）克隆而得到，可连续培养。
2．生长培养基DMEM（高糖型，含4500mg/L D－葡萄糖、L-谷氨酰胺，和110mg/L丙酮酸钠，不含碳酸氢钠）＋５％～10％新生牛血清+ 1％双抗（青霉素和链霉素）的培养液。
3．冻存液生长培养基＋10％DMSO4．细胞健康生长的几项注意事项1）细胞没有支原体等外源因子的感染。
2）培养液的pH值可在7.0－7.3，以7.2为佳。
3）一般按1：3传代，细胞接种密度为1－1.5×105cells/ml，48hr后长成单层。
4）培养基和血清的质量可靠、稳定；建议采用特级小牛血清。
5）细胞及时传代，不可以在老化后传代，一般在刚长成细胞单层时进行传代、扩增。
6）细胞传代时消化液用0.25％胰蛋白酶+0.03％EDTA，消化过程应尽量缩短在1～2分钟内完成。
二、病毒感染、维持和收获转瓶中细胞长成单层后，弃瓶内细胞生长液，接种PRRS病毒。
37℃吸附1hr，加入维持液，置37℃恒温室转瓶机上旋转培养3－5天。
维持液：DMEM+4～5％新生牛血清。
pH应为7.4～7.8；后期维持pH会慢慢降下来。
细胞病变时间出现在接毒后48小时，72～96小时细胞病变达80％左右，当细胞出现80%以上病变（CPE）时，即可开始收毒；反复传过几代后病变时间可缩短。
第3、4天注意观察，细胞病变（CPE）达到80％时收获病毒，－20℃冻融3次，混匀病毒悬液，96孔板测定TCID50。
收液时需要将含毒细胞反复冻融2～3次以破碎细胞，将病毒释放到培养液中。
三、细胞病变（CPE）细胞在接种病毒后，24－48hr开始出现病变，72－96hr约达到80％病变。
病变现象：细胞空泡化、圆缩、先灶状脱落，再大片脱落，最后整个细胞裂解、破碎。
图1是长成单层的marc 145细胞，图2、图3和图4均是指PRRSV感染后，出现细胞病变的Marc 145细胞。
Marc—145细胞传代培养条件优化
Marc—145细胞传代培养条件优化摘要采用单因素法研究在细胞传代培养过程中复苏温度、血清浓度、生长液pH值、培养温度、消化液浓度、传代比例等因素对Marc-145细胞传代培养的影响。
结果表明：复苏温度37 ℃、血清浓度10%、生长液pH值7.2、培养温度37 ℃、消化液浓度0.25%、传代比例1∶3时Marc-145细胞传代培养效果最佳。
Abstract Using single test，the effect of recovery temperature serum concentration，growth solution pH value，incubation temperature，concentration of digestive fluid and passage rate on the subculture for Marc-145 cells was studied.The results showed that the best subculture conditions for Marc-145 cells was when the recovery temperature was 37 ℃，the serum concentration was 10%，growth solution pH value was 7.2，incubation temperature was 37 ℃，concentration of digestive fluid was 0.25%，and passage rate was 1∶3.Key words Marc-145 cells；subculture；single test；condition optimizationMarc-145细胞为上皮样细胞，来源于猴肾细胞，从母细胞（MA 104细胞）克隆而得到，可连续传代培养[1]。
Marc-145细胞作为猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的受体细胞，近年来已被得到广泛应用。
细胞培养相关知识点
细胞培养相关知识点
细胞培养是指将细胞从体内或体外来源中采集到培养基中，通过提供合适的营养物质和环境条件使其在体外无限制地生长和繁殖的一种生物学实验技术。
常见的细胞培养技术包括原代细胞培养和细胞系培养。
1. 培养基：细胞培养中使用的培养基是包含多种营养物质的液体或固体培养基。
常见的培养基种类包括DMEM、RPMI-1640、MEM等，并根据细胞的类型和特殊需要进行相应的改制。
2. 细胞分离：通过一系列的操作将组织中的细胞分离出来，常用的方法有机械剪切、酶消化和离心等。
3. 细胞传代：细胞的传代是指将细胞从旧的培养皿中转移到新的培养皿中，以保持细胞的生长状态和增殖能力。
细胞传代的方法有裂解法、胶原酶法和选择性黏附法等。
4. 培养条件：细胞的生长需要适宜的温度、湿度、pH值和气体环境。
常见的培养条件为37℃、5% CO2和95%湿度。
5. 防止细胞污染：细胞培养中常见的污染源有细菌、真菌和支原体等。
常用的防止污染的方法包括消毒培养器具和介质、使用无菌操作等。
6. 细胞检测：常用的检测方法包括细胞形态观察、细胞数量计
数、细胞活力测定、染色体核型分析和细胞分化等。
7. 细胞培养的应用：细胞培养技术在生物医学研究中有广泛的应用，如药物筛选、疾病模型建立、组织工程和基因工程等。
注：以上所列举的知识点为细胞培养的基本内容，具体的细胞培养操作方法和技巧可根据具体实验需求和细胞类型进行进一步学习。
Marc_145细胞微载体悬浮培养及PRRSV增殖工艺的建立
江苏农业学报（Jiangsu J．of Agr．Sci．），2012，28（3）：598 603冯磊，褚轩，吴培培，等．Marc-145细胞微载体悬浮培养及PRRSV 增殖工艺的建立［J ］．江苏农业学报，2012，28（3）：598-603．Marc-145细胞微载体悬浮培养及PRRSV 增殖工艺的建立冯磊，褚轩，吴培培，王伟峰，侯继波（江苏省农业科学院国家兽用生物制品工程技术研究中心，江苏南京210014）收稿日期：2011-12-08基金项目：江苏省农业自主创新基金项目［DCX （09）4065、DCX （10）2049］作者简介：冯磊（1979-），男，江苏南通人，博士，助理研究员，从事兽用生物制品工程技术研究。
（Tel ）025-********；（E-mail ）fenglnt@yahoo．com．cn通讯作者：侯继波，（E-mail ）houjibo@jaas．ac．cn 摘要：采用分批式培养方法研究了Marc-145细胞微载体悬浮培养及猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV ）增殖工艺。
结果表明，在3g /L 的微载体用量下，采用1ml 3ˑ105个细胞的初始接种密度及培养至第3d 进行换液操作工艺可以获得最佳的Marc-145细胞生长效能。
采用感染复数为0.05的接毒比例及接毒后48h 收获毒液可获得最高的PRRSV 增殖效价。
在5L 反应器中重复验证上述工艺，获得较为稳定的试验结果，最大细胞密度均可高于1ml 2ˑ106个细胞，PRRSV 的增殖效价均高于108．0TCID 50/ml 。
为猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗的生物反应器规模化生产奠定了基础。
关键词：Marc-145细胞；微载体；猪繁殖与呼吸综合征病毒；悬浮培养中图分类号：S852．65文献标识码：A文章编号：1000-4440（2012）03-0598-06Microcarrier suspension culture of Marc-145cells and propagation of PRRSVFENG Lei ，CHU Xuan ，WU Pei-pei ，WANG Wei-feng ，HOU Ji-bo（National Research Center of Veterinary Bio-product Engineering and Technology ，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences ，Nanjing 210014，China ）Abstract ：Batch-wise suspension culture of Marc-145cells on microcarriers （cytodex 1）and propagation of porcinereproductive and respiratory syndrome virus （PRRSV ）were investigated．The optimal growth efficiency could be achieved by 3ˑ105cells per 1ml inoculation on 3g /L microcarriers concentration and media replacement after 3-d culture．The highest PRRSV titer was achieved with 0．05multiple of infection （MOI ）on Marc-145cells at 48h post infection．All con-ditions for Marc-145cells microcarriers suspension culture and PRRSV propagation mentioned above were confirmed in 5L bioreactor repeatedly ，resulting in the highest cell density above 2ˑ106cells per 1ml and PRRSV titer above 108．0TCID 50/ml．The optimal processes achieved in this study laid the experimental foundation for mass production of PRRS vac-cines in bioreactor scale．Key words ：Marc-145cell ；microcarrier ；PRRSV ；suspension culture猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive andrespiratory syndrome ，PRRS ）是一种严重危害养猪业的传染病（猪蓝耳病）［1-7］，给养猪业造成了巨大经济损失。
第1章细胞培养的基本知识-10页word资料
第一篇细胞工程的基本技术——细胞培养技术第1章细胞培养的基本知识第一节基本概念和名词细胞培养(cell culture)技术即是选用各种细胞的最佳生存条件对活细胞进行培养和研究的技术，是广泛应用于医学研究领域的重要技术。
它起源于1885年，德国人Roux用温生理盐水在体外培养鸡胚髓板，并使之存活了数月之久，第一次获得组织块人工培养成功。
1906年，Beebe和Ewing用盖玻片悬滴培养法，以动物血清做培养基，培养狗淋巴细胞存活了72小时，并曾见到细胞生长现象。
1907年，Harrison用淋巴液做悬滴培养，使来自两栖类胚胎神经组织的神经细胞存活了若干天，还观察到神经管细胞分化成了神经元，而且向培养液中伸出了轴突，与脑、脊神经细胞在体内分化的情况很类似。
以后Carrel进行了改进，并十分注意培养中的无菌操作技术。
他用血浆包埋组织块外加胎汁的培养法，通过采用更新培养基和分离组织的传代措施，完善了经典的悬滴培养法。
1923年，他又设计了用骨化瓶培养法，以扩大组织的生存空间。
50年代，组织培养技术有了更快的发展，从改进培养操作技术、培养器皿和培养基方面进行了改进。
各种培养瓶、培养基孕育而生。
1957年Dulbecco实验室采用胰蛋白酶消化处理，使成块的组织分散成单个细胞，进行悬液培养，从而开创了细胞培养技术。
用单层细胞培养法可以建立很多细胞系(cell line)，通过单细胞分离培养法又可建立克隆细胞株(clone或cell strain)。
细胞系(cell line)系原代培养经首次传代成功后即成细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞世系所组成。
细胞株(cell strain)系通过选择法或克隆形成法，从原代培养物或细胞系中获得的具有特定性质或标志的细胞群。
细胞株的这种特定性或标志必须在整个培养期间始终存在。
克隆(clone)系指由同一个祖先细胞通过有丝分裂所产生的遗传性状相同的细胞群体。
医学研究中泛指的体外培养包括细胞培养、组织培养和器官培养。
细胞培养基础知识
肿瘤个人精准医疗
二、细胞培养所需的环境
1、内部环境
基本营养物质: 包括氨基酸、维生素、碳水化合物及一些无机离子。 1、氨基酸是组成蛋白质的基本单位，培养细胞时有12种氨基酸是必 需的，另外尚需谷氨酞胺。 2、维生素是维持细胞生长的生物活性物质。 3、碳水化合物提供细胞的能源，其中主要的是葡萄糖。 4、培养细胞的生长尚需要钠、钾、镁、钙、磷等基本的天机离子些 都是细胞组成所必需并参与细胞的代谢。
细胞培养基础知识
一、细胞培养简介以及相关概念 二、细胞培养所需的环境 三、细胞培养所需的设备 四、细胞培养涉及的相关技术
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一、细胞培养简介以及相关概念
1、概念
细胞培养：指从动物或植物中取出细胞，然后使其在合适的人工环境中生长。这些细胞可于培养 前直接从组织中取出并采用酶或机械方法进行解离，或者也可来自已经建立的细胞 系或细胞株。
促细胞生长因子：体外培养细胞既需要上述基本营养物质．还需要促细胞生长因子等 物质才能正常生长、增殖。
1、血清 2、根据培养细胞用于的目的不同加入不同的细胞因子进行刺激如：
IL-3:促进粒细胞、巨噬细胞其他类型细胞生长 GM-CSF:刺激于细胞分裂及分化为粒细胞及巨噬细胞
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二、细胞培养所需的环境
肿瘤个人精准医疗
一、细胞培养简介以及相关概念
2、分型
悬浮型细胞：某些细胞在瓶皿中生长时不贴壁，呈悬浮状态，称无贴壁依赖性
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淋巴母细胞群
二、细胞培养所需的环境
1、概述
细胞培养所需的环境可以分为：供细胞繁殖生长所处的内部环境和操作细胞所 处的外部环境两个部分。
内部环境：基本营养物质、促细胞生长因子等
细胞培养技术简介
基本营养物质：氨基酸、维生素、碳水化合物及 一些无机离子。 促生长因子、激素等物质
★ 气体环境：95％空气加5％CO2混和气体环境中。 ★ PH值：7.2～7.4 ★ 温度：37℃
二、细胞培养用品简介
1、常用仪器 超净工作台 （laminar cabinet ） 利用鼓风机驱动空
2、细胞培养用液及培养基（液） :
（1）水：去离子水、双蒸水、三蒸水，可高压除菌 。 （2）平衡盐溶液（BBS）：可以维持渗透压、调节PH值以 及供给细胞生存所需的能量和无机离子成分。主要作为合成 培养基的基础液及用来洗涤组织、细胞等。如PBS。 （3）消化液：在原代培养中需要分散组织、细胞，在传代 中要使细胞脱离附着的底物时需使用消化液。分为胰蛋白酶 液、EDTA及胶原酶等。如胰蛋白酶液，可以使细胞间的蛋 白质水解、细胞分散。
细胞培养技术简介
• 2、消毒: 在组织细胞培养技术中，务必保证组织细胞在无微生物 的条件下生长。防止培养物污染可通过消毒灭菌（将已存 在的微生物去除）和无菌操作技术（防止已经消毒灭菌的 用品被污染）来完成。
细胞培养技术简介
消毒灭菌的方法 :
★ 物理方法: 湿热（高压蒸汽）、干热、紫外线 照 射线、过滤、离心沉淀等方法杀灭或去除微生物. ★ 化学方法:使用化学消毒剂、抗菌素等杀灭微 生物。
细胞培养 的作用
细胞内胞 质的活动
胞质与胞 核之间的 流动
细胞培养基础知识
生长特点: 细胞之间紧密相 靠、互相衔接， 具有连接成片的 能力。如LNCaP 细胞。
原代培养
培养细胞分类
传代培养 贴附生长型细胞
上皮细胞型
培养细胞类型
成纤维细胞型
细胞培养知识大全
细胞培养实验技术大全第一章细胞培养的基本原理与技术现代生物技术一般认为包括基因工程技术、细胞工程技术、酶工程技术和发酵工程技术，而这些技术的发展几乎都与细胞培养有密切关系，特别是在医药领域的发展，细胞培养更具有特殊的作用和价值。
比如基因工程药物或疫苗在研究生产过程中很多是通过细胞培养来实现的。
基因工程乙肝疫苗很多是以CHO细胞作为载体；细胞工程中更是离不细胞培养，杂交瘤单克隆抗体，完全是通过细胞培养来实现的，既使是现在飞速发展的基因工程抗体也离不开细胞培养。
正在倍受重视的基因治疗、体细胞治疗也要经过细胞培养过程才能实现，发酵工程和酶工程有的也与细胞培养密切相关。
总之，细胞培养在整个生物技术产业的发展中起到了很关键的核心作用。
第一节体外培养的概念一、基本概念体外培养（in vitro culture），就是将活体结构成分或活的个体从体内或其寄生体内取出，放在类似于体内生存环境的体外环境中，让其生长和发育的方法。
组织培养：是指从生物体内取出活的组织（多指组织块）在体外进行培养的方法。
细胞培养：是指将活细胞（尤其是分散的细胞）在体外进行培养的方法。
器官培养：是指从生物体内取出的器官（一般是胚胎器官）、器官的一部分或器官原基在体外进行培养的方法。
二、体内、外细胞的差异和分化1、差异：细胞离体后，失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响，生活在缺乏动态平衡相对稳定环境中，日久天长，易发生如下变化：分化现象减弱；形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡；或发生转化获得不死性，变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系。
因此，培养中的细胞可视为一种在特定的条件下的细胞群体，它们既保持着与体内细胞相同的基本结构和功能，也有一些不同于体内细胞的性状。
实际上从细胞一旦被置于体外培养后，这种差异就开始发生了。
2、分化：体外培养的细胞分化能力并未完全丧失，只是环境的改变，细胞分化的表现和在体内不同。
细胞是否表现分化,关键在于是否存在使细胞分化的条件，如Friend细胞（小鼠红白血病细胞）在一定的因素作用下可以合成血红蛋白，血管内皮细胞在类似基膜物质底物上培养时能长成血管状结构，杂交瘤细胞能产生特异的单克隆抗体，这些均属于细胞分化行为。
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一．Marc-145细胞培养
1.细胞消化传代
Marc-145细胞培养48-72小时后，将细胞用0.2%的胰酶消化后以1：3的比例传代。
细胞培养液（6%小牛血清、1%双抗、93%DMEM培养液），细胞维持液（3%小牛血清、1%双抗、96%DMEM培养液）。
2.细胞冻存（15ml中号培养瓶）
将细胞形态较好，细胞活力旺盛（即传代后36-48小时细胞长成单层面）用
0.2%的胰酶
消化后加入细胞冻存液20ml（30%小牛血清、10%二甲基亚砜DMSO、60%DMEM 培养液），混匀后2ml/管分装，放入细胞冻存盒置-70℃冰箱72小时后放入液氮罐保存。
3.细胞复苏
将液氮罐中的细胞快速取出，置37℃温水中解冻，再将解冻后的细胞1000转离心5分钟，在无菌操作台内小心倒掉上清，加入1ml细胞培养液后吹打混匀，吸入到5ml细胞培养瓶内，在加入5ml细胞培养液。
marc 145细胞培养的简单综述
2008-07-25 00:00 来源：丁香园点击次数：1930 关键词：marc 145细胞细胞培养综述
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一、细胞及培养
1、Marc145细胞
上皮样细胞，来源于猴肾细胞，从母细胞（MA 104细胞）克隆而得到，可连续培养。
2、生长培养基
DMEM（高糖型，含4500mg/L D－葡萄糖、L-谷氨酰胺，和110mg/L丙酮酸钠，不含碳酸氢钠）＋5－10％新生牛血清+ 1%双抗（青霉素和链霉素）的培养液。
3、冻存液
生长培养基＋10% DMSO
4、细胞健康生长的几项注意事项
（1）细胞没有支原体等外源因子的感染。
（2）培养液的pH值可在7.0－7.3，以7.2为佳。
（3）一般按1：3传代，细胞接种密度为1－1.5×105cells/ml，48hr后长成单层。
（4）培养基和血清的质量可靠、稳定；建议采用特级小牛血清。
（5）细胞及时传代，不可以在老化后传代，一般在刚长成细胞单层时进行传代、扩增。
（6）细胞传代时消化液用0.25%胰蛋白酶+0.03%EDTA，消化过程应尽量缩短在1～2分钟内完成。
二、病毒感染、维持和收获
转瓶中细胞长成单层后，弃瓶内细胞生长液，接种PRRS病毒。
37℃吸附1hr，加入维持液，置37℃恒温室转瓶机上旋转培养3－5天。
维持液：DMEM+4～5％新生牛血清。
pH应为7.4～7.8；后期维持pH会慢慢降下来。
细胞病变时间出现在接毒后48小时，72～96小时细胞病变达80％左右，当细胞出现80%以上病变（CPE）时，即可开始收毒；反复传过几代后病变时间可缩短。
第3、4天注意观察，细胞病变（CPE）达到80％时收获病毒，－20℃冻融3次，混匀病毒悬液，96孔板测定TCID50。
收液时需要将含毒细胞反复冻融2～3次以破碎细胞，将病毒释放到培养液中。
三、细胞病变（CPE）
细胞在接种病毒后，24－48hr开始出现病变，72－96hr约达到80％病变。
病变现象：细胞空泡化、圆缩、先灶状脱落，再大片脱落，最后整个细胞裂解、破碎。
图1是指PRRSV感染后，出现细胞病变的Marc 145细胞。
四、PRRS病毒在细胞中增殖规律（Virology Journal, 2006, 3: 90）
PRRS病毒感染Marc 145细胞过程可大致分为两个感染阶段，第一阶段：病毒感染细胞后的20－22hr左右，仅部分细胞被随机感染，而且Marc 145细胞对PRRS病毒的低感染性（low permissiveness）与MOI量无关，因为MOI剂量比常规量提高100倍，感染22hr后，仍仅5.5%的细胞呈PRRSV阳性（PRRSV-positive）。
第二阶段：感染后的2－3天（也称为病毒
的对数感染期），病毒感染蔓延是通过相邻细胞和细胞之间的接触感染，细胞对自由病毒不敏感（Cells is nonpermissive to free Virus），并出现了感染细胞群。
感染过程如图5所示。
对我们的一点启示：可以采用适当低量的MOI进行病毒感染，比如0.05virus/cell；同时，大部分细胞在维持期的第一天尚需继续生长，而且病毒在2－4天才是感染、增殖的高峰，较长的病毒维持期均需要供给丰富的营养物资，可以相信：维持液的营养成分对病毒增殖效率有非常重要的影响。