培养方法对土壤可培养细菌多样性的影响

滴胶囊法 [ 12 ]和扩散小室法 [ 13 ]等均是具有革命性的 方法 ,能够很好地模拟原位环境条件 ,既有通用性又 无需昂贵设备 。然而 ,土壤环境中存在某些菌体微 小 、生长缓慢的微生物类群 ,适当延长培养时间有助 于其生长成为肉眼可见的菌落 ,但延长培养时间对 培养环境的无菌要求较高 ,目前研究仅限于对土壤 细菌数量和菌落形态等方面进行分析 。
单菌落集中挑到对应的培养基上培养 ,倒置于 30℃ 恒温培养箱培养直至长出可见菌落 , 4℃保存作为菌 体 PCR模板 。 11312 菌落 PCR 扩增 16S rDNA 16S rDNA 引 物 序 列 : 63f: 5′2CAGGCCTAACACATGCAAGTC23′, 1387 r: 5′2GGGCGGW GTGTACAA GGC23′[ 16 ] 。扩增体 系 (25μl)如下 :模板 :用牙签挑少量菌体 , Buffer 215 μl, dNTP ( 20 mmol L - 1 ) 2 μl, Mg2 + ( 25 mmol L - 1 ) 2μl, 20%吐温 ( Tween 20 /无菌水 : V /V ) 2 μl,正反 向引物各为 015 μl, Taq酶 ( 5 U μl- 1 ) 015 μl,无菌 双蒸水补至 25 μl。扩增条件 : 94℃预变性 4 m in; 94℃变性 30 s, 50℃复性 30 s, 72℃延伸 1 m in,此步 骤共 30 个 循环 ; 72℃延伸 10 m in; 10℃冷 却 10 m in。所得 PCR产物通过 0175%的琼脂糖电泳 , EB 染色后紫外分析仪检测 。
6期
王 萍等 :培养方法对土壤可培养细菌多样性的影响
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用年限 30年以上 。该地区亚热带暖湿季风气候 ,年 平均气温 1517℃,年平均降水量 1 128 mm。土壤 pH5145,有 机 质 含 量 为 2912 g kg- 1 , 全 氮 含 量 为 1196 g kg- 1 ,土壤含水量 27163%。采样深度为 0～ 15 cm ,按照五点采样法采集相邻 5个地点的土壤样 品 ,混合 、封装带回 。除去石块和植物根系等杂物 , 4℃冰箱中保存 。 112 培养基与试剂
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土 壤 学 报
ຫໍສະໝຸດ Baidu
46卷
倍 。延长培养时间能够大大提高平板生长的细菌数 量 , LB 培养基培养 48h后细菌数量为 5144 ×107个 CFU ,至 192 h达 14184 ×107个 CFU ,增加 1173倍 , 同期 W SA 和 CSEA 培养基上的细菌菌落数量增加 更多 ,分别增加 6151倍和 10158倍 。
培养基 LB、W SA 和 CSEA 上的细菌 16S rDNA 克隆 文 库 库 容 ( Coverage C ) 值 分 别 为 90170% 、 92166%和 84162% 。同时从不同培养基的细菌种 系型丰度趋势线也可以看出 (图 2 ) ,由 W SA 培养 基获 得 的 土 壤 细 菌 建 立 的 16S rDNA 克 隆 文 库 O TU S类型最多 ,丰富度最高 ; LB 类型最少 ,丰富 度最低 。
关键词 微生物多样性 ;可培养性 ; RFLP分析 ;培养基 ;培养时间 中图分类号 S154134; Q93811 文献标识码 A
土壤微生物具有极高的多样性 [ 1 ] ,在土壤生态 系统形成与演化过程中发挥一系列重要的生态功 能 ,如有机物的周转 、养分的释放 、腐殖酸的形成 、污 染物的降解 、土壤结构的改善等 [ 2～4 ] 。但目前在实 验室条件下采用纯培养方法所获得的微生物种类十 分有限 ,例如细菌域包括 23门 ,但是大约只有 6 250 种是已知的 [ 5 ] ,估计小于 1%的微生物可以通过纯 培养的方法来培养 [ 6, 7 ] 。大量的未培养微生物的存 在严重制约了对土壤微生物生态功能的认识 ,而低的 土壤微生物可培养性又使获得纯培养菌株变得极其 困难 ,致使对这类微生物形态 、生理特性 、代谢功能等 生命活动规律无法深入进行 ,因此纯培养技术的局限 已经成为土壤微生物生态学研究的主要瓶颈 。
第 46卷 第 6期 2009年 11月
土 壤 学 报
ACTA PEDOLOGICA SIN ICA
Vol146, No16 Nov. , 2009
培养方法对土壤可培养细菌多样性的影响3
王 萍 1 崔中利 1 刘 标 2 孙 波 3 曹 慧 1
(1 南京农业大学农业部农业环境微生物工程重点开放实验室 ,南京 210095) (2 国家环境保护部南京环境科学研究所 ,南京 210042) (3 中国科学院南京土壤研究所 ,南京 210008)
113 实验方法 11311 平板计数 按照稀释平板计数法制备 10 - 1 ～10 - 7的土壤悬液 ,取 10 - 5 、10 - 6 、10 - 7三个稀 释度的土壤悬液 011m l分别涂布于三种培养基平板 上 ,每个稀释度每种培养基涂布 4个重复平板 ,倒置 于 30℃恒温培养箱培养 ,按照 0 ～24 h、24 ～48 h、 48～72 h、72～96 h、96～144 h、144～192 h的时间 段对三种培养基分别计数 。将相同时间内培养出的
本研究采用的三种不同类型培养基的营养成份 有较大差别 ,阐明培养基类型对土壤可培养细菌群 落结构的影响 ;通过延长培养时间获得更多的土壤 细菌数量 ,并对土壤细菌 16S rDNA 进行 PCR 2RFLP 分析 ,揭示培养时间对土壤可培养细菌数量与多样 性之间的关系 。藉此筛选出一种获得更多土壤细菌 数量 、更高土壤细菌多样性的培养方法 ,为土壤微生 物资源挖掘 、开发新的活性物质奠定科学基础 。
11313 限制性酶切 PCR 产物 限制性内切酶
Hha I是一种四碱基的酶 ,酶切位点丰富 ,甚至可以 对某一类细菌直接分类 [ 17 ] 。酶切体系 : 10 ×M buff2 er 1μl, PCR 产物 2μl, Hha I 015μl,无菌双蒸水补 至 10μl, 37℃水浴过夜 。 11314 聚丙烯酰胺凝胶 ( PAGE)电泳 酶切产 物用 8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳分开 , 30 m l PAGE 体系为 : 1518 m l水 , 6 m l 5 ×TB E, 210 μl 10% AP, 20μl TEM ED , 7198 m l 30%丙烯酰胺 。恒流 30 mA , 约 3 h分离 , 再剥胶银染 (包括染色 、显色两个步 骤 ) ,最后扫描仪扫描 、保存图片 。 11315 RFLP分析 以基因片段多态图像为基础 进行聚类 ,根据不同图像间的相似性将所有的图像 聚合成一个聚类树 。通过聚类分析而被聚合到一起 的具有相同基因图像的基因 ,我们则认为它们是相 同的基因型 。每一个基因型称为一个操作分类单位 (Operational Taxonom ic Units, OTU s) 或称为唯一基 因型 [ 18 ] 。 11316 数据分析 多样性指数的计算方法参照 文献 [ 19 ]进行 , 16S rDNA 克隆文库的库容 ( Cover2 age C)值的计算公式参照文献 [ 20 ]。 11317 测序及系统发育树的构建 三种培养基 培养出的优势菌群由上海英骏生物公司完成测序 工作 ,测出的 16S rDNA 基因序列在 NCB I网站中 比对同 源 性 并 提 交 GenB ank 数 据 库 , 登 录 号 为 : FJ386560, FJ386562, FJ386564 ～ FJ386568。根 据 NCB I同源性 比 对 的 结 果 , 从 核 酸 数 据 库 中 下 载 同源性高的 16 S rDNA 序列以及不同分类来源的 代表性 16 S rDNA 序列 ,用 B ioEd it将序列转换为 FA STA 格 式 。以 上 FA STA 格 式 文 件 用 C lu stalX 进行多序列比对 后 , 用 M EGA 进 行 分 析 比 对 , 最 后通 过 邻 接 法 ( ne ighbo r2jo in ing) 生 成 系 统 进 化 树。
2 结 果
211 土壤细菌平板培养的数量 三种培养基在不同时间段内对土壤细菌平板计
数的结果见图 1。从图中可以看出 ,不同培养基获 得的细菌菌落数量有较大差别 ,总体而言 LB 培养 基上生长的细菌数量最多 ,其次为 CSEA 培养基 , W SA 培养基在相同培养条件的细菌数量最少 。LB 培养基上 6个时段每 g干土获得的细菌平均数量为 8170 ×107个 CFU ( colony2form ing unit) ,是 W SA 培 养基和 CSEA 培养基平均数量 的 2136 倍和 1197
1 材料与方法
111 土壤样品 样品采集于江苏省宜兴市洋溪镇的老菜地 ,利
3 国家自然科学基金项目 (40871125, 40871123) 、环保公益性行业科研专项 (200709047)和江苏省自然科学基金项目 (BK2006501)资助 通讯作者 , E2mail: hcao@ njau. edu. cn, Tel: 025284396753 作者简介 :王 萍 (1983～) ,女 ,硕士研究生 ,主要从事环境微生物分子生态学研究 收稿日期 : 2008 - 12 - 09;收到修改稿日期 : 2009 - 04 - 10
近年来 ,在改进微生物培养方法 、开发新型培养 技术方面国内外开展了较多的研究工作 ,分离获得 了一批新的微生物菌株 。如通过改变培养基的配 方 [ 8 ] 、降低培养基营养成分 [ 9 ] 、添加某些微生物生 长因子 [ 10, 11 ]可显著提高平板培养的土壤微生物种 类和数量 ;采用多种培养基组合亦可提高土壤微生 物的可培养性 ;此外 ,一些新型原位培养技术 ,如微
摘 要 提高土壤微生物的可培养性 ,获得纯培养微生物菌株 ,是微生物生态学研究的基础 。采用三 种培养基对土壤细菌进行分时段计数 ,以细菌通用引物扩增细菌 16S rDNA 片段 ,用限制性内切酶 Hha I酶切 PCR产物 ,对酶切图谱进行分型 ,研究不同培养方法对土壤细菌多样性和可培养的影响 。结果表明 , LB、 CSEA、W SA培养基 192 h后每 g干土获得的细菌数量分别为 14184 ×107、10127 ×107和 6191 ×107 CFU ,但微 生物多样性指数以 W SA为最高 , LB 多样性指数最低 ; 三种培养基培养的细菌菌群有一定的相似性 , LB 和 CSEA 培养基间的 Jaccard指数为 57169% , LB和 W SA 培养基之间为 53113% ,而 CSEA和 W SA 培养基的相似 性指数达 66167% ; 16S rDNA 测序结果表明 ,所获得的土壤细菌优势种群在分类方面主要属于 γ2和 β2变形杆 菌以及放线菌亚门 ,其中某些 OTU s中的 16S rDNA 序列与 B u rkholderiaceae bacterium、R hodococcus和 M ycobac2 terium 属具有较高的同源性 ,推测其细胞能够分泌复苏促进因子 ,有效地提高土壤细菌的可培养性 。
限制性内切酶 Hha I购于大连宝生物工程有限 公司 ,丙酰胺 、过硫酸胺 、四甲基己二胺均购自南京 创瑞公司 , Taq酶等 PCR 试剂购自上海申能博彩公 司 , 16S通用引物由上海英骏生物公司合成 , Tween 20 购于南京赛吉有限公司 。
采用三种细菌培养基 ,即 LB 培养基 、W SA 培养 基 (W inogradsky’s salt2solution agar) [ 14 ] 和 CSEA 培 养基 ( Cold extracted soil extract agar) [ 15 ] 。LB 培养 基是细菌通用培养基 ,营养物质浓度最高 ; W SA 培 养基是由少量的无机盐组成的培养基 ,其营养物质 浓度较低 ; CSEA 培养基是由土壤浸提液制成的 ,其 营养物质浓度最接近土壤环境 。