激光诱导荧光检测微流控芯片生化分析仪的研制

仪器装置与实验技术激光诱导荧光检测微流控芯片生化分析仪的研制
程永强1　张涛
1　王鹗2　王伟2　徐光明1　方群
311(浙江大学化学系微分析系统研究所,杭州310058) 2(上海光谱仪器有限公司,上海200233)
摘　要　研制出一种集激光诱导荧光检测、微流控芯片电泳及控制系统于一体的生化分析仪。

分析仪内采用可重复使用的玻璃基质微流控芯片,利用销式固定技术实现芯片的精确定位,定位精度达到±2μm 。

以四触点高电压系统控制芯片上的进样和电泳分离操作。

激光诱导荧光检测系统采用正交光路模式,对Cy5染料的
检出限达到110×10-10mol/L (S /N =3)。

以羟乙基纤维素为筛分介质,初步进行了ΦΧ1742Hae Шdigest DNA
marker 限制性片段的毛细管电泳分离。

关键词　微流控芯片,毛细管电泳,生化分析仪,激光诱导荧光检测
　2007202211收稿;2007206207接受
本文系国家自然科学基金(No .20575059)、教育部(No .NCET 20520511)、浙江省科技厅(No .2004C13001)和上海光谱有限公司资助3E 2mail:fangqun@zju .edu .cn
1　引　言
微流控分析技术自20世纪90年代兴起后,取得了迅速发展。

随着相关研究的深入,部分微流控分
析技术已开始从基础研究阶段进入了产业化和市场开发阶段[1,2]。

以分析仪器集成化和微型化为目标
的研究,成为当前微流控芯片分析最活跃的研究领域之一。

目前,市场上销售的商品化微流控分析仪器多为国外公司生产,其中以采用激光诱导荧光检测的分析仪最为普遍。

但此类仪器在不同程度上均存在着价格昂贵、维护费用高、兼容性差的局限性。

因此,研制一种成本低廉、集成度高、适合于产业化应用的激光诱导荧光检测芯片分析仪,成为当前微流控芯片分析仪器发展的主要目标之一。

本研究报道了一种集成化激光诱导荧光检测微流控芯片生化分析仪,仪器内集成了微流控毛细管电泳芯片、激光诱导荧光检测系统、四触点高压电源系统、内置单片机控制系统等部分。

微流控芯片采用可重复使用的玻璃基质芯片,利用定位销技术,可使激光束准确地聚焦于芯片通道内。

激光诱导荧光检测系统采用具有自主知识产权的正交检测光路模式,有效地降低了仪器的成本和减小仪器的体积。

该生化分析仪已被初步应用于DNA 片段的芯片毛细管电泳快速分离。

2　实验部分
211　材料与试剂
红敏荧光染料Cy5(GE Healthcare );ΦΧ1742Hae ШdigestDNA marker (大连宝生物工程有限公司);羟乙基纤维素(HEC,MW 250000,Sig ma 公司);DNA 荧光标记染料T O 2PRO 23(Molecular Pr obes 公司);甲基酰氧基丙基三甲氧基硅烷(MAPTS,Sig ma 公司);丙烯酰胺、过硫酸铵、四甲基乙二胺(上海生工生物工程有限公司);1×T BE,Tris 2硼酸2乙二胺四乙酸(E DT A )体系,pH 912,由10×T BE 稀释而成(上海生
工生物工程有限公司)。

其它试剂均为分析纯,实验用水为超纯水(电阻率18ΜΩc m 2)。

Cy5溶液配制:在购买的Cy5试剂管内加入1mL 脱水乙腈,配制成浓度为510×10-5mol/L 的储备
液,然后用1×10-2mol/L 硼砂缓冲液(pH 912)稀释配制标准溶液。

212　仪器组成
分析仪由微流控毛细管电泳芯片、激光诱导荧光检测系统、高压电源系统、控制系统等部分组成。

仪器外观尺寸:40c m ×30c m ×25c m 。

自制高压电源系统可提供四触点高压输出,每触点电压输出(范围0～6000V )可单独控制。

控制系统包括硬件和软件两部分。

硬件由内置的单片机控制系统和信号第36卷2008年1月 分析化学(FE NX I HUAXUE )　仪器装置与实验技术Chinese Journal of Analytical Che m istry
第1期127～131
采集及放大模块构成,内置单片机(MCU P89C669)通过D /A 转换实现对四路高压和光电倍增管负高压输出,以及电极架升降操作的控制;同时,光电倍增管收集的荧光信号,经信号采集及放大模块处理,通过单片机A /D 转换输入到外置的计算机,由计算机进行数据处理和显示。

仪器的所有参数设定、控制和信号采集,均通过RS232串口线与计算机实现通讯。

软件为V isual Basic 编写的计算机应用程序,可智能控制四路高压切换,完成芯片毛细管电泳进样和分离操作。

计算机实时界面可监控四路高压值和光电倍增管负高压,同时可以设定对荧光检测信号的滤波等级、谱图显示及数据处理、保存等参数。

图1中a 和b 分别为生化分析仪外观图和基本结构框图。

　图1　微流控芯片分析仪外观图(a )和结构框图(b )
Fig .1　Phot ograph (a )and sche matic diagra m (b )of the m icr ofluidic chi p based bi oanalyzer
213　激光诱导荧光检测系统
激光诱导荧光检测系统光路结构如图2所示。

光源采用发射波长为635nm 、功率为4mW 的半导体激光器(南京来创激光科技有限公司)。

激光束垂直于芯片平面,经前置带通滤光片(635±10)n m ,沈阳汇博光学股份有限公司)滤光,由聚焦透镜汇聚于芯片分离通道。

其中激光器,前置带通滤光片,聚焦透镜三者构成一体化模块。

荧光检测系统由收集透镜、小孔、带通滤光片(670±10)nm ,沈阳汇博光学股份有限公司)和光电倍增管(R928型,北京滨松光子技术有限公司)四部分组成。

在芯片正交偏45°方向上检测出射的荧光
[3,4]。

　图3　(a )微流控芯片通道构型示意图;(b )一体化芯
片照片;(c )芯片定位原理示意图
Fig .3　Configurati on of the m icr ochannel on chi p (a );i m age of the integrated m icr ofluidic chi p (b );sche matic diagra m of l ocating p rinci p le for m icr ofluidic chi p (c )
214　微流控芯片加工采用文献[5]报道的光刻和湿法刻蚀以及高温
键合方法,制得通道结构如图3a
所示的玻璃芯片
　图2　激光诱导荧光检测系统光路结构示意图
Fig .2　Sche matic diagra m of the op tical configurati on of
the laser induced fluorescence (L I F )detecti on system (62mm ×15mm )。

芯片微通道深20μm ,宽70
μm ,分离通道长615c m ,有效分离距离为415c m 。

821 分析化学第36卷
通道的末端用直径为1mm 钻头钻孔,作为微通道进出口。

对芯片靠近分离通道的侧壁进行抛光处理,抛光后通道距离侧壁115mm 。

在芯片的微通道进出口处,分别固定直径为5mm 、高为10mm 的塑料管作为储液池。

将加工好的芯片放于定制的芯片架内。

如图3b 所示,芯片架由底板和盖板两部分组成,在底板上加工直径为3mm 的两个圆孔,使其刚好卡在底座平台的两个定位销上。

预调节芯片的位置,使激光斑点恰好处于芯片通道中央,将芯片固定在支架底板上,最后将盖板固定于底板上,形成一体化芯片。

图3c 为芯片定位原理图。

215　实验操作
对Cy5染料的电泳分离实验,采用门式进样法[6]。

实验前,芯片通道先用浓H 2S O 4浸泡20m in,用超纯水将浓H 2S O 4冲洗干净后,再用1mol/L Na OH 溶液浸泡10m in,最后用超纯水将Na OH 溶液冲洗干净,用10mmol/L 的硼砂缓冲溶液(pH 912)充满通道。

在储液池D 中加入50μL Cy5溶液,在其余3个储液池A \,B 、C 中加入50μL 硼砂缓冲溶液。

由计算机程序控制芯片上A 、B 、C 和D 储液池在进样和分离阶段的电压和时间(具体条件见表1),并实时记录荧光信号。

对DNA 样品的电泳分离采用夹流进样法[7],芯片需要进行微通道表面预涂覆处理[8]。

以215%羟乙基纤维素(溶剂1×T BE )作为筛分介质。

将筛分介质经0145μm 微孔滤膜过滤,取1mL 过滤后的筛分介质加入1μL 1mmol/L 荧光染料T O 2PRO 23,混合均匀后充入芯片微通道并在4个储液池中分别加入30μL 。

首先进行预电泳20m in,待基线稳定后,将储液池A 中的凝胶用等量的DNA 样品代替,进行电泳分离。

DNA 样品取自015g/L 的ΦΧ1742Hae Шdigest DNA marker,用超纯水稀释10倍作为DNA 样品进行分离,具体分离条件见表2。

表1　Cy5电泳分离实验条件
Table 1　Conditi ons f or Cy5separati on
充样操作Samp ling p r ocedure
液池电压Cell voltage (V )
A
B C D 时间Ti m e (s )分离操作Separating p r ocedure 液池电压Cell voltage (V )A B C D 时间Ti m e (s )5000500800450001000800100　
表2　DNA 片段电泳分离实验条件
Table 2　Conditi ons f or CE separati on of DNA freg ments m ixtures
充样操作Samp ling p r ocedure
液池电压Cell voltage (V )
A
B C D 时间Ti m e (s )分离操作Separating p r ocedure 液池电压Cell voltage (V )A B C D 时间
Ti m e (s )0100200120503608003600600　
3　结果与讨论
311　激光诱导荧光检测系统
激光诱导荧光检测系统的光路结构直接影响其性能。

本仪器采用了自主研发的正交型光路系统[3,4],具有光路结构简单、容易搭建和实现微型化、灵敏度高等优点。

在前期工作基础上,本研究着重对光路系统中的检测光路进行了优化。

在实验中观察到,检测光路中小孔直径的变化对检测信号影响较大。

直径过小,光斑易偏离光路,造成仪器稳定性较差;直径过大,会使杂散光进入检测器,造成仪器空白噪声变大,信噪比降低。

综合考虑上述两种影响,实验选择小孔直径为210mm 。

由收集透镜收集的荧光汇聚到小孔处后,又呈发散状出射。

为了使光电倍增管尽可能多的接收到荧光信号,应将滤光片紧靠于小孔出口,光电倍增管与小孔之间距离保持在110c m 之内。

这样既可使系统结构紧凑,便于模块化,又能保证仪器的高检测灵敏度。

312　芯片定位系统
在采用激光诱导荧光检测系统的微流控芯片分析仪器中,为在测定时使激光聚焦斑点位于芯片微通道中央,通常有两种芯片定位方法。

一是在显微镜辅助观察下,手动调节位于x 2y 2z 三维平移台上的芯片,使之准确定位。

此方法虽较为可靠,但需在仪器内附加显微镜和平移台等设备,增加了系统的体921第1期程永强等:激光诱导荧光检测微流控芯片生化分析仪的研制
积和造价,同时,也增加了使用者操作的复杂性。

对于以商品化为目的的芯片分析仪而言,并非是一种最佳的选择。

二是采用可自动调焦的激光诱导荧光检测系统,使激光聚焦斑点自动定位于芯片微通道中央。

目前,在Agilent 公司推出的商品化芯片分析仪Agilent 2100B i oanalyzer 中,即采用此方法。

但使用此种定位方法的激光荧光检测系统结构较为复杂,对系统的制造技术要求较高,不易实现。

本研究采用了一种操作简单快速的芯片定位方法———芯片架辅助定位法,可实现高精度的芯片定位。

在芯片生产过程中,利用显微镜、三维平移台和激光诱导荧光检测系统进行芯片预定位操作,然后固定芯片与芯片架的相对位置,使之成为一体化芯片。

在实际使用中,只需将一体化芯片插入底座平台上的定位销,即可实现芯片的精确定位,不需再使用显微镜和平移台。

该方法显著简化了仪器使用者的实验操作,提高了分析仪的实用性。

实验中,对一体化芯片的定位精度进行了考察。

采用同一个一体化芯片,连续重复进行固定和取出操作11次,以CCD 摄像机拍摄每次固定后芯片微通道的照片,结果显示,对于直径为10μm 的激光斑点,在70μm 宽的芯片微通道内的定位精度达到±2μm 。

图4为其中6
次定位后拍　
图4　用CCD 拍摄的定位后的芯片微通道与激光斑点照片Fig .4　CC D i m ages of the m icr ochannel and laser focu 2sing s pot 摄的芯片微通道与激光斑点照片。

313　分析性能
以Cy5为试样考察系统的检测灵敏度。

测定采
用门式进样法,通过调控进样时间长短来控制进样
量。

为消除电动进样带来的歧视效应,进样时间选
择为4s 。

电压条件如表1所示。

结果显示,在所测
定的浓度范围(510×10-10～510×10-8mol/L )内,
系统对Cy5的荧光检测信号与浓度呈线性关系,线性回归方程为:H =1151×1010C +5128,r =01999,其中C 为Cy5的浓度,H 为响应信号峰高。

系统对Cy5的检出限为110×10-10mol/L (S /N =3)。

314　D NA 片段分离
图5　ΦΧ1742Hae Шdigest DNA marker 芯片电泳分离图
Fig 15　Electr opher ogra m of separati on of ΦX 1742Hae Шdigest DNA marker
采用所研制的生化分析仪初步进行了DNA 试
样的分离。

实验中考察分离场强(100～200V /c m )
的变化对分离性能的影响。

当分离场强过高时,产
生显著的焦耳热,会造成谱带展宽,分离度降低。

分
离场强过低,会延长分离时间。

经实验优化的分离
场强为130V /c m ,具体的电泳分离条件见表2。

采
用上述条件,对11个DNA 片段的混合试样进行分
离,结果如图5所示。

多数DNA 片段得到较好分离,
理论塔板数介于611×105～215×106m -1之间。

但271bp 和281bp 两片段因碱基数相差较小而未能实现完全分离。

一体化芯片系统可多次重复使用。

当
分离效率降低时,更新微通道内的筛分介质,可以恢
复到初始的分离效果。

4　结　论
本研究报道了一种采用激光诱导荧光检测系统的微流控芯片生化分析仪。

在激光诱导荧光检测技术和芯片精确定位技术方面,该仪器拥有自主知识产权。

与现有商品化芯片分析仪比较,本仪器具有结构简单、造价低、芯片定位操作方便的特点。

微流控芯片可多次重复利用,显著降低了分析成本。

目前,课题组正在对仪器的性能进行进一步的完善,同时优化和拓展本分析仪在生物化学领域内的应用。

031 分析化学第36卷
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D evelopm en t of I n tegra ted M i croflu i d i c Ch i p 2ba sed B i oana lyzer
w ith La ser 2i n duced Fluorescence D etecti on
Cheng Yong 2Q iang 1,Zhang Tao 1,W ang E 2,W angW ei 2,Xu Guang 2M ing 1,Fang Qun
311
(Institute of M icroanalytical Syste m s,D epart m ent of Che m istry,Zhejiang U niversity,Hangzhou 310058)2(Shanghai Spectrum Instrum ents Co .,Shanghai 200233)
Abstract An integrated bi oanalyzer involving m icr ofluidic chi p,high voltage power supp ly,laser 2induced fluorescence (L I F )detecti on syste m and contr ol syste m was devel oped t o perfor m cap illary electr ophoresis separati on .An orthog onal op tical arrange ment was e mp l oyed in the L I F detecti on syste m t o si m p lify the struc 2ture of the syste m with a li m it of detecti on of 110×10-10mol/L for Cy5dye .A si m p le and convenient app r oach f or accurately l ocating the chi p in the bi oanalyzer was devel oped by using a chi p supporter and base pegs with a chi p positi on variati on of ±2μm.The perfor mance of the p resent bi oanalyzer was de monstrated in the CE separati on of a ΦΧ1742Hae Шdigest DNA marker .
Keywords M icr ofluidic chi p,cap illary electr ophoresis,bi oanalyzer,laser 2induced fluorescence detecti on
(Received 11February 2007;accep ted 7June 2007)
《生命分析化学》
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全书共1023页,定价98元。

由科学出版社出版。

131第1期程永强等:激光诱导荧光检测微流控芯片生化分析仪的研制 。