短梗五加果抗炎活性成分及其药物动力学研究

短梗五加果抗炎活性成分及其药物动力学研究短梗五加Acanthopanax sessiliflorus（Rupr.Et.Maxim）Seem.为五加科五加属植物,主产于中国,韩国和日本等地,具有滋补强壮、祛风除湿的功效。

短梗五加果为短梗五加的成熟干燥果实,本文对短梗五加果的化学成分、抗炎活性和主要活性成分的药物动力学进行了研究。

采用大孔吸附树脂柱色谱、硅胶柱色谱、Sephadex-LH20柱色谱、ODS开口柱色谱及制备-HPLC等分离手段从短梗五加果甲醇提取物中分离得到了44个化合物,通过理化性质、1D-NMR、2D-NMR、MS等光谱手段,对42个化合物进行了鉴定。

其中三萜类化合物10个:分别为3-oxo-24-methylenecycloartan（1）,甘五酸（2）,异五味子酸（3）,白桦脂醇（4）,白桦脂酸（5）,五加苷K（6）,22-α-hydroxychiisanogenin（7）,chiisanogenin（8）,22α-hydroxychiisanoside （9）,（1R,11α）1,4-epoxy-11-hydroxy-3,4-secolupane-20（30）
-ene-3,28-dioic acid（10）;甾体类化合物1个:豆甾醇（11）;黄酮类化合物4个:分别为isooirenitn（12）,芦丁（13）,异鼠李素-3-O-芸香糖苷（14）,儿茶素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖（15）;紫罗兰酮类化合物3个:分别为icariside B₁（16）,icariside B₂（17）,（6R,7E,9R）
-9-hydorxy-4,7-megastigmadien-3-one9-O-β-D-apiofuranosyl-（1-6）-β
-D--glucopyranoside（18）;木脂素类化合物7个:分别为（+）
-l-hydroxypinoresinol-l-O-β-D-glucoside（19）;苯甲酸类:（7S,8R）dihydrodehydrodiconiferyl alcohol 4-O-β-D-glucopyranoside（20）,蛇菰宁（21）,berchemol-4’-O-β-D-glucoside（22）,落叶松脂醇-4,4′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（23）,icariside E3（24）,（75,8R）赤型-7,9,9’-三羟基-3,3’
二甲氧基-8-O-4’-新木脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷（25）;苯丙素类化合物6个:分别为coniferin（26）,4-O-（2-O-β
-D-glucopyranosyl-1-hydroxymethylethly）-dihydroconiferyl alcohol （27）,1-烯丙基-3-甲氧基-6-O-β-D-呋喃芹糖（1’’-6’）-β-D-吡喃葡萄糖苷（28）,hovetrichoside G（29）,eugenylβ-rutinoside（30）,3-甲氧基苯丙烯醇-4-O-β-D-葡萄糖苷（31）;酚酸类化合物6个:分别为香草酸-4-O-β-D-葡萄糖苷（32）,红景天苷（33）,4-羟基苯基苄基-β-D-葡萄糖苷（34）,4-O-β-D-吡喃葡萄糖基-3,5-二甲氧基没食子酸（35）,香子兰酸酯葡萄糖苷（36）,2-羟基-5-（2-羟乙基）苯-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（37）;含氮类化合物5个:分别为川芎哚（38）,3-羧基川芎哚（39）,腺苷（40）,1-methyl-1,2,3,4-tetrahydro-β-carboline-3-carboxylic acid（41）,3-羟基-L-脯氨酸（42）。

化合物2,3,14,18,19,23,24,25,27,28,31,37,41,42为首次从五加属Acanthopanax中分离得到;化合物6,13,16,17,22,32,39为首次从该植物Acanthopanax sessiliflorus中分离得到。

通过建立脂多糖诱导小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞释放炎症因子模型对短梗五加果进行抗炎评价。

首先,采用MTT法测定了短梗五加果甲醇提取物乙酸乙酯层和正丁醇层部位对RAW264.7细胞的毒性影响,筛选出合适的梯度浓度（50、100、200 mg/L）进行给药,采用Griess法考察了乙醇提取物乙酸乙酯层和正丁醇层部位分别对LPS 诱导RAW264.7细胞NO释放的影响,结果发现,正丁醇部位的抗炎活性明显优于乙酸乙酯层。

其次,我们挑选了从正丁醇部位分离得到的5个三萜类化合物（化合物5,6,7,8,10）进行同样方法的体外抗炎活性研究。

结果表明5,6,10具有明显的抗炎活性,其中化合物10的抗炎活性最佳。

因
此,我们从分子水平进一步考察了化合物10抗炎的机制,本实验选定iNOS和COX-2作为考察指标,通过Western Blot和PCR技术检测iNOS和COX-2的表达,进一步验证此结果。

LPS诱导RAW264.7细胞后,iNOS和COX-2的蛋白和mRNA水平表达显著升高,而给药组其蛋白和mRNA表达则明显降低。

这些结果表明化合物10可减少LPS 诱导的NO的分泌,其作用机制主要是通过减低iNOS和COX-2基因表达。

建立了测定大鼠血浆中四种三萜类成分的UPLC-ESI-MS/MS分析方法。

采用液-液萃取法进行血浆样品预处理,色谱柱为ACQUITY UPLC^TM BEH C₁₈ column（1.7?m,50mm×2.1mm,i.d）;流动相为5mmol/L醋酸铵水溶液-乙腈（10:90,v/v）,等度洗脱;采用负离子检测方式,MRM扫描模式。

利用该法分别研究了大鼠灌胃给予高、中、低3个剂量的4种三萜类化合物[22-α-hydroxychiisanogenin,chiisanogenin,（1R,11α）
1,4-epoxy-11-hrdroxy-3,4-secolupane-20（30）-ene-3,28-dioic acid和22-α-hydroxychiisanoside]和相当于短梗五加果70%乙醇提取物后的药物动力学行为。

统计学检验结果表明,在所研究的剂量范围内,4种三萜类化合物在大鼠体内呈线性药物动力学特征。

与给药4种单体相比,给药短梗五加果70%乙醇提取物后的
AUC_0-t降低P（<0.05）;大鼠血浆中22-α
-hydroxychiisanogenin和chiisanogenin的药-时曲线出现双吸收峰现象。

建立了同时测定大鼠血浆中原儿茶酸（PCA）,东莨菪苷,（-）-松脂醇-4,4’-di-o-β-D-吡喃葡萄糖苷（PDG）,短梗五加苷D,短梗五加苷B和金丝桃苷的UPLC-MS/MS 分析方法。

采用液-液萃取法进行血浆样品预处理,色谱柱为采用Agilent
SB-C₁₈column C₁₈色谱柱（1.7?m,100 mm×2.1 mm,i.d.）;流动相为甲醇-0.1%甲酸水,质谱采用多反应监测（MRM）模式在负离子模式下进行检测。

方法线性良好,日内、日间精密度、准确度、提取回收率和稳定性均符合生物样品测定要求。

利用该方法对大鼠灌胃给予短梗五加果70%乙醇提取物后的药物动力学行为进行研究,为短梗五加果的临床应用以及给药方案的设计提供参考。

提供了各成分的药动学参数。

原儿茶酸,东莨菪苷,（-）-松脂醇-4,4’-di-o-β-D-吡喃葡萄糖苷,短梗五加苷D,短梗五加苷B和金丝桃苷的C_max分别为198.1±60.3
ng/mL,734.1±203.4 ng/mL,447.1±104.5ng/mL,356.7±145.2ng/mL,409.5±133.2ng/mL,103.7±46.3ng/mL;T_max分别为1.5±0.5 h,0.5±0.3 h,1.0±0.4h,0.5±0.3h,0.5±0.2 h,0.25±0.3 h。