16 植物原生质体融合技术

用于细胞核或细胞质失活的方法 ：
物理方法常采用射线处理，如X射线、γ射线等， 它们能使细胞核失活； 化学处理：核失活－碘乙酰胺（IOA）、碘乙 酸(Iodoacetate)；质失活－罗丹明（R－6－ G，它是一种亲脂染料，能够抑制线粒体的氧 化磷酸化过程而达到失活作用。
（三）植物体细胞杂交发展历程 1971年，Takebe离体烟草原生质体培养首 次获得再生完整植株； 1972年，Carlson首次获得第一个植物细胞 杂种――粉蓝烟草和郎氏烟草的细胞杂种。 1974年，Kao采用聚乙二醇诱导融合法诱导 植物细胞融合，建立了相应的融合技术； 1978年，Melchers首次获得属间细胞杂种 （番茄＋马铃薯 ) 1981年，Zimmerman发明了电融合仪，并 首次提出了电融合概念）体细胞杂交的类型
根据融合时细胞的完整程度，原生质体融合 可分为两大类： · 对称融合（asymmetric fusion）——即两个 完整的细胞原生质体融合。 · 非对称融合（symmetric fusion）——利用物 理或化学方法使某亲本的核或细胞质失活后 再进行融合。
体细胞杂种的应用潜力
1、 植物育种中的核质替换 2、 细胞质杂种的获得 3、 远缘杂交创造新物种 4、 细胞器的互作研究
体细胞杂交研究的发展趋势
1、 诱导融合及杂种细胞的各种生理、生
化、遗传机理的研究
2、 电融合的程序化控制研究
3、 各种类型原生质体（胞质体、核质体、
细胞器）的制备技术研究 4、 杂种细胞培养技术的程序化研究
电融合中的主要融合参数：包括交流电 压、交变电场的振幅频率、交变电场的 处理时间；直流高频电压、脉冲宽度、
脉冲次数等。
融合技术要点：
融合液：CaCl2.2H2O 8~10mmol
KH2PO4 0.7mmol
甘露醇或山梨醇 0.5~1.0mol
pH 5.6
诱导液：融合液＋PEG 20～45％
4、选择杂种的方法
应用遗传或生理互补的选择方法能够在愈 伤组织水平或再生植株中有效地选择杂种，但 应考虑到杂种细胞生长发育过程中染色体的丢 失，因此，进行杂种选择时要小心谨慎。
5、由杂种细胞诱导获得再生植株是否 杂种的鉴定方法
· 形态鉴定：根据双亲的形态学性状观察进行鉴定。
· 细胞学鉴定：细胞器鉴定、染色体鉴定。 · 生化鉴定：同功酶鉴定。 · 分子鉴定：RFLP鉴定、RAPD标记鉴定。
影响原生质体融合的因素
首先，原生质体质量对细胞的融合起着至关 重要的作用，高质量的原生质体是细胞融合 的首要条件。 其次，融合方法 其三是融合参数，包括各种融合液都应选择 适当。
第三节 杂种细胞的发育动态及 体细胞 杂种应注意的问题
一、体细胞杂种的特点
形态上的趋中性 变异幅度大 非整倍性 双亲性状的共显性 偏亲现象
2、原生质体的制备
体细胞融合一般要求新鲜、制备时间
较短的原生质体，因分离时间过长，原 生质体开始长壁，影响融合效果。
3、融合方法
经改良的电融合法要优于PEG法，而且操作简 便，对细胞无毒害作用（Bates and Hazenkampt, 1985），诱导频率较高。但由于 电融合需要昂贵的电融合仪，这种方法现在应 用并不普遍。 PEG法操作比较复杂，融合效果受原生质体的 生理状态、纯度、密度和PEG的质量和浓度、 处理时间、钙离子浓度、洗液成分以及诱导融 合程序等因素影响较大，在融合时应加以考虑。