褪黑素对大鼠急性脊髓损伤内质网应激蛋白GADD153／CHOP表达的影响

褪黑素对大鼠急性脊髓损伤内质网应激蛋白GADD153／CHOP表

达的影响

目的探讨褪黑素（MT）对急性脊髓损伤（ASCI）大鼠模型脊髓组织GADD153/CHOP表达的影响。方法选取健康SD大鼠96只，随机分为生理盐水处理组（NS组）、乙醇处理组（ET组）及褪黑素治疗组（MT组）各32只。所有大鼠均以改良Allen法制备脊髓损伤模型；MT组在模型制备的基础上给予褪黑素治疗；ET组在模型制备的基础上给予5%乙醇处理；NS组在模型制备的基础上给予0.9%氯化钠溶液处理。分别于伤后3 h、1 d 、3 d、7 d时各取8只应用改良Tarlov评分法评价其神经功能；Tarlov评分后处死，取受损节段脊髓行HE染色及免疫组化染色，观察形态学改变和CHOP表达的特点；并应用TUNEL方法检测神经细胞凋亡情况。其量的评定借助于麦克奥迪数码医学图像分析系统A（Motic.med 6.0）软件，结果分别用累积光密度（IOD）及细胞凋亡指数（AI）来表示。结果所有实验大鼠脊髓组织均有不同程度出血、水肿、细胞凋亡及坏死。MT组Tarlov评分除3 h时间点外，其他各时间点Tarlov评分明显高于ET组及NS组，且差异有统计学意义（P 0.05）。结论MT可抑制CHOP 表达，降低脊髓细胞凋亡指数，可能为其发挥急性脊髓损伤保护作用的重要机制之一。

标签：褪黑素；急性脊髓损伤；GADD153/CHOP；细胞凋亡；药物治疗

现代研究结果显示[1]，急性脊髓损伤（actue spinal cord injury，ASCI）后存在广泛细胞凋亡现象。细胞凋亡是一种程序性的细胞死亡，目前大量研究认为其对损伤后神经功能产生重要的影响[2]，是导致继发性脊髓损伤的主要原因[3]。以往认为细胞凋亡信号传导通路包括线粒体和死亡受体途径[4]。最新研究表明，内质网应激也参与了细胞凋亡，其中CHOP/GADD153（C/EBP homologous protein/growth arrest-and DNA damage inducible gene 153）是内质网应激特异的转录因子[5-6]，可由DNA生长停滞性损害诱导产生。黄怀等[7]发现内质网应激可以诱导大鼠ASCI神经细胞的凋亡，加重脊髓的损伤及神经功能障碍，该研究还发现ASCI组织CHOP表达含量的高低与ASCI的严重程度一致。CHOP又称内质网应激促凋亡蛋白，是继发性脊髓损伤发生机制的重要因素之一。褪黑素（melatonin，MT）是人体重要神经内分泌活性物之一，主要由松果体分泌，因此也称为松果体素。目前，MT对脊髓损伤的保护作用是国外研究的热点。据相关文献报道，MT对脊髓的保护作用主要通过线粒体通路或者死亡受体通路而实现，关于MT通过内质网通路发挥脊髓保护作用的文献鲜有报道。本实验旨在观察褪黑素对大鼠ASCI后脊髓组织内质网应激相关蛋白GADD153/CHOP表达的影响，探讨其对脊髓损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

96只健康6～8周SD大鼠，雌雄各半，体重200～250 g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司[许可证号SCXK（湘）2009-0004]，在中南大学实验动物学部[许可证号：SYXK（湘）2005-0005]分笼饲养。采用单盲法将96只大鼠随机分为3组，生理盐水处理组（NS组）、乙醇处理组（ET组）及褪黑素治疗组（MT组）各32只；根据损伤的时间点又分为3 h、1 d、3 d、7 d 4个处理组，每组8只，雌雄各半，在相应时间点进行指标考察。

1.2 动物模型制备

以改良Allen法制备脊髓损伤大鼠模型。制备方法：（1）1%戊巴比妥钠（0.1 mL/kg）腹腔注射麻醉，俯卧位固定于解剖板；（2）以浮肋与13胸椎连接处为基准点，在5 cm2范围内脱毛，显露光滑皮肤组织；（3）酒精消毒，以消毒器械操作，在后正中线2～3 cm做纵行切口，依次切开皮肤、筋膜，可见白色腱膜；（4）借助剥离分针钝性剥离椎旁肌肉丛，可暴露棘突、椎板和横突；（5）定位并标记T10胸椎，在椎体上下中横向切口，再以2个纵向切口将其连接成方形结构，并以咬骨钳去除该骨板，显露方形骨窗；（6）以自制Allen撞击器打击T10胸椎内侧，保持自由落体运动，控制高度为2.5～3.0 cm，每次击打保持在打击点提留2～3 min；（7）至脊髓组织出现血肿，硬脊膜呈紫红色停止击打，缝合伤口；（8）术后单笼饲养，每1小时给大鼠翻身一次，直至大鼠完全清醒；（9）青霉素联合庆大霉素抗感染，并人工辅助排尿、排便，保持垫料清洁，并及时清理伤口分泌物；（10）术后30 min给予药物处理：MT组给予腹腔内注射褪黑素（Sigma，100 mg/kg），按照褪黑素说明书要求，用无水乙醇（安徽安特生物化学有限公司）對褪黑素进行溶解，并以0.9%氯化钠溶液进行稀释，其稀释浓度为5%。NS组和ET组以同样方法给予同剂量的0.9%氯化钠溶液或5%乙醇。

1.3 神经功能评价

本实验对大鼠术后清醒初期做首次Tarlov评分，剔除0分及5分大鼠（完全性瘫痪大鼠恢复的可能性很少，完全正常者没有评估的价值），并补充后备实验大鼠，以保证实验大鼠的可比性；1～4分者大鼠继续实验，分别选取术后3 h、1 d、3 d、7 d 4个时间点，按照改良Tarlov标准进行神经功能评定，（表1）。

表1 改良Tarlov评分标准1.4 心脏灌注和组织观察

1.4.1 心脏灌注（1）1%的戊巴比妥钠（0.1 mL/kg）腹腔注射麻醉，仰卧位固定于解剖板，自腹腔中线开始解剖，向上打开胸腔，适当断除肋骨，暴露心脏；（2）以止血钳牵拉，撑开心脏入口，固定两侧肌肉，进行心脏穿刺；（3）用中号静脉滴注针头（磨除针尖）自左心尖斜行穿至右侧主动脉，动脉夹固定针头，（4）先以50 mL注射器推注0.9%氯化钠溶液4～5针（200～250 mL），剪破右心耳；

控制适当流速，勿鼓破血管，至肝脏颜色无色、右心耳流出的液体澄清，体循环内血液彻底流出；（5）拔掉注射器，连接4%多聚甲醛滴注瓶，排除气泡，进行多聚甲醛灌注固定40～90 min，大鼠身体可完全僵硬。

1.4.2 组织提取以T9～T11胸椎为中心，取损伤阶段脊柱约2 cm，以巩膜