骨髓间充质干细胞体外诱导分化与标记(一)

骨髓间充质干细胞体外诱导分化与标记(一)

作者：吴晓林,李冬民,马德茂,张晓田,黄石,宋天保

【关键词】骨髓

【Abstract】AIM:Tostudythedifferentiationcharacteristicsandtheoptimaldosageandtimingforbromodeoxyuridi ne(Brdu)labelingofratbonemarrowderivedmesenchymalstemcells(MSCs)invitro.METHODS:Therat marrowstemcellsisolatedbyusingPercoll(1.073kg/L)wereculturedandproliferated.Thethirdpassage cellswereinducedwithdexamethasome,βglycerophosphate,ascorbicacid2phosphate,IGF1andinsuli n.Onday21,thecellswereanalyzedbyimmunohistochemistryfortypeⅠcollagenandbyhistochemistry foralkalinephosphatase(AKP).ThepurifiedMSCswereincubatedwithBrduatdifferentconcentrations( 5,10and15μmol/L)fordifferenttimeperiods(12，24，48，72and96h),followedbyimmunohistochemistryforBrdutoidentifytheoptimalBrduconcentrationandi ncubationtimeperiod.RESULTS:Afterincubationfor21dforinduceddifferentiationintoosteoblasts,ty peⅠcollagenandAKPwerepositivelyexpressed.Theincubationwith10μmol/LBrdufor72hachievedov er98%ofthelabelingratewithoutproducingobviouscelldamages.CONCLUSION:MSCscanbeinducedt odifferentiateintoosteoblastsundercertainconditionsinvitro.TheoptimalBrdulabelingconcentration andtimeperiodare10μmol/Land72h,respectively.

【Keywords】MSCs;induceddifferentiation;osteoblast;Brdu

【摘要】目的：探讨骨髓间充质干细胞（MSCs）在体外的诱导分化及5溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)标记MSCs的可行性.方法：利用密度为1.073kg/L的percoll分离骨髓的单个核细胞，体外培养与扩增MSCs；取生长良好的第3代细胞，用成骨细胞分化培养液培养21d，Ⅰ型胶原免疫组化染色和碱性磷酸酶（AKP）组化染色；分别以浓度为5，10和15μmol/L的Brdu溶液标记MSCs，孵育12，24，48，72和96h后免疫组化检测Brdu，确定最佳标记量和最佳标记时间.结果：诱导分化第21日,AKP染色呈强阳色,Ⅰ型胶原免疫染色呈阳性.10μmol/LBrdu 标记MSCs的效果最好，随着孵育时间的延长，Brdu标记率逐渐增高，标记72h后标记率在90%以上.结论：MSCs在体外一定条件下可定向诱导分化为成骨细胞，用Brdu标记MSCs的最佳浓度为10μmol/L，最佳时间是72h.

【关键词】骨髓间充质干细胞；诱导分化；成骨细胞；5溴脱氧尿嘧啶核苷

0引言

骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)是一类具有多向分化潜能的组织干细胞.因MSCs取材方便、对机体的损伤小、具有较强的传代增殖能力和免疫耐受性等特点而受到越来越多的关注.本实验的目的是利用MSCs具有分化潜能的特点，在体外诱导该细胞定向分化为成骨细胞.并用Brdu标记连续传代的MSCs，观察最佳标记时间及标记剂量，从而为追踪Brdu标记的MSCs移植入体内后的存活、生长及分化奠定基础.

1材料和方法

1.1材料健康雄性SD大鼠，体质量55～70g.由西安交通大学医学院实验动物中心提供.

1.2方法

1.2.1大鼠骨髓MSCs的体外分离培养将大鼠引颈处死后置于750mL/L乙醇浸泡约5min，无菌条件下分离出大鼠的股骨和胫骨.用PBS冲洗出骨髓细胞，经5mL针管反复吹打制成单细胞悬液，用200目的不锈钢网过滤，收集滤液.在密度为1.073kg/L的percoll（Phamacia）分离液上缓慢加入收集的滤液，2500r/min离心20min，收集滤液与分离液之间的白膜层细胞，用DMEM（Gibco）洗涤两次，1000r/min离心5min.用加有100mL/L胎牛血清（杭州四季青公司）的DMEM重悬细胞，1×108个/L种于两个直径为6cm的培养皿中培养，2d后更换培养液，加入完全培养基.并将吸出的旧培养液分别移入另两个平皿中继续培养，再过2d更换

成完全培养基.以后每3～4d换液1次，弃去没有贴壁的悬浮细胞.待细胞生长融合到约80%，用0.2g/LEDTA和2.5g/L胰蛋白酶（宝信公司）消化，1∶2传代培养.

1.2.2传代后大鼠MSCs向成骨细胞的分化胰酶消化生长良好的第3代（P3）细胞，以1×107个/L密度种于6cm培养皿中，平皿中预先加入0.5cm×1.0cm无菌盖玻片.待细胞长到约80%融合后，加入含200mL/L胎牛血清的DMEM诱导24h，弃去.加入诱导液，其中含0.1μmol/L 地塞米松、50μmmol/L维生素C,10μmmol/Lβ甘油磷酸钠、IGF1（Chemikon）,胰岛素和100mL/L 胎牛血清.同时，设立正常对照组，只加入含100mL/L胎牛血清的培养基，其余均不加.分别诱导7，14和21d.取出盖玻片，PBS冲洗，40g/L多聚甲醛固定15min.然后应用抗Ⅰ型胶原mAb（Sigma）和ABC法（ABC试剂盒购于北京中杉公司）进行Ⅰ型胶原免疫组织化学染色.加入诱导液组，以PBS和正常鼠血清分别替代一抗作为阴性对照；应用组织化学钙钴法显示碱性磷酸酶（AKP），以不加底物β甘油磷酸钠的孵育液作为阴性对照.

1.2.3Brdu标记MSCs消化P3细胞，以0.5×108个/L将MSCs接种于12孔培养皿，在将要加入Brdu的培养皿中预先放入无菌盖玻片.当细胞铺满皿底40%时加入Brdu（Sigma）溶液，使其终浓度分别为5，10和15μmol/L.孵育12，24，48，72和96h后取出盖玻片，用PBS 冲洗，40g/L多聚甲醛固定15min，应用抗BrdumAb（Sigma）和ABC法进行免疫组织化学染色显示Brdu，除在正常血清封闭前以2mol/L盐酸变性30min外，其余均按试剂盒说明书进行操作.以PBS和正常鼠血清分别替代一抗作为阴性对照.另外，将用10μmol/LBrdu标记的MSCs进行传代培养，观察细胞传代后的标记效果.