骨髓间充质干细胞体外诱导分化与标记(一)
mdx鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养及向肌细胞的诱导分化
a n
ti
m o u s e
M HC
a n
t ib o d y
pu
ha
d
G
u a n
g
ho
．
u
u a n
f rO m C h e
g do
a ：
n
m
ic
o n c o m
pa
o
y dx
e s m
5 100 8 0
P ro
。
G
．
g
v
in c
e
C h in
t
o
M E T HO DS
a
：B
MS C s
。
f
n r
La bo b b il
ra
to r y
．
．
．
a n
d
raw e re
n jm a rc
I
s e
n iv e r s
it y
z
．
p e r im
ta l C
e n te r
S
n
Ya t
s e n
U n iv
B
a s
ic f b r o b l a i
t g
ro w
c to r a n
ra
t o ry is
o
f t h e F i r s t A f ili a t e d
Ya t s e
—
n
M A T E R IA L S
E
x
：T e n
m a le
，
dx
ge d 4
e rs
6
it y
w e e
丹酚酸B体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究
诱 导分 化为心肌样细胞 。但 ５一ａａ作为抗肿瘤药 物具 有一定的 ２ 方 法 ｚ 毒副作用 ， 寻找 安全 、 故 有效 的诱 导剂 应是 目前 的重 要课 题 。我 ２ １ ＭＳ ｓ ． Ｃ 的分 离培养 将大 鼠脱颈处死 ， 无菌条件下取 双侧股
们前期的研究结果表 明 Ｓｌ ａＢ可 以减 小心肌 梗塞 的面积 ， 并能 骨 、 骨 ， 胫 适量 Ｄ—Ｈ ｎ ￣液冲洗骨髓 ，０ ａｋ １０目筛 网过滤 ， 密度为 将 有效地促进梗塞灶 内成纤维细 胞 的增 生 ， 速心脏 的修复 过程。 １０ ３／ ｌ Ｐ ｒ ｌ预 先 置 于 试 管 的 底 部 ， 后 按 照 １ １的 比 加 ．７ ｇｍ 的 ｅｃ ｌ ｏ 然 ：
分化为心肌样细胞 的研究 。现将研究结果报道如下 ｎ 后接种 于完全培养 液 （ １ ％胎 牛血清 、０ ／ ／ ｉ， ｉ） ａ 含 ０ １０ｍｇＬ 青 霉素 、０ ／ １０ｍｇＬ链霉素 的 Ｌ—Ｄ Ｍ 培养液 ） 置 于 ３ ５ ＭＥ ， ７Ｃ、％ ９
那么 ， 对有 心肌分化 潜能的 ＭＳ ｓ 什么作用 呢？为进一 步研 例沿管壁缓慢滴加骨髓悬液 ， 它 Ｃ起 ・ 离心（ ０ ／ ｉ，０ ｍｎ ， １８０ｒｍｎ ２ ｉ） 收获位 究其机制 ， 我们进 行了中药单 体丹 酚酸 Ｂ Ｓｌ 体 外诱 导 ＭＳ ｓ 于界面层灰 白色 的单个核细胞 ， Ｌ—Ｄ Ｅ （ａ Ｂ） Ｃ 用 Ｍ Ｍ离心洗涤 ２次（ ０ ８０
向心 肌 细 胞 分 化 的 能 力 。
关键 词 ： 丹酚酸 Ｂ 骨髓间充质干细胞； 体外诱导； 免疫细胞化学； 实时荧光定量 Ｒ — Ｃ ； Ｔ ＰＲ
中图分类 号 ：９２ Ｒ ７
文 献标 识码 ： Ａ
文章编 号 ：０８００ （０ ８ ０ －５４０ １０ —８５ ２ ０ ）３０７ －３
兔骨髓间充质干细胞来源的心肌(样)细胞的诱导分化研究
死模型 。实验动物 随机分两组 ： 实验组 （ ｎ＝１ ） ０ 在心梗 区域注人经诱导后的 ＭＳ ｓ对照组 （ １ ） Ｃ； ｎ＝ ０ 在心
梗 区域注人不含 ＭＳ ｓ的培养液 。移植 ４周后 ， Ｃ 进行病 理标本 观察 和免 疫组化检 测。结果
Ｃ Ｎ ｉ ｉｇ， ＸＩ Ｊａ — ｎ ＨＥ Ｌ— ｎ ｘ ＡＯ ｉｎｍｉｇ， Ｓ Ｎ ｉ —ｕ Ｕ Ｊｎｈ ａ， ＮＩ Ｊ ｎ， Ｃ Ｉ Ｈｏ ｇ ｙ ｈ Ｚ ＮＧ Ｍｉ ， Ｃ Ｅ ｕ Ａ ｎ —ａ 。 ＨＡ ｎ ＡＯ
Ｊｎ — ｎ ．Ｄ ｐ．ｏ ａｄｏ ｇ 。Ｔ ｅＦ ｉ ｍｉ ｇ ｇ ｅｔ ｆ Ｃ ｒｉｏ ｙ ｈ ￡Ａ ｌ ｔ ｏｐｔｌｏ ｕ ｍｉｇ Ｍｅｉ ｌＣ ｌｇ 。Ｋ ｎ ｎ ｌ ｆ ｉ ｅ Ｈ ｓｉ Ｋ ｎ ｎ ｄｃ ｏ ｅｅ ｕ ｍｉｇ ｉ ｆ ａｄ ａｆ ａ ｌ
维普资讯
中国微循环 ２ ０ ０７年 ８ 月第 １ 卷第 ４期 １
文章编号 ：０ ７８ ６ （０ ７ ０ －２ ５０ １０ — ８ ２０ ）４０ ３ －５ ５
・
２ ５・ ３
实验 研 究 ・
兔骨髓问充质干细胞来源的 心肌 （ ） 样 细胞 的诱导分化研究
ｌ ｔ ｏｅｅｄ ｔ ｒ ｒ ｓＬ Ｄ ｆ ０ｒ ｂｔ ｈ ｅｅｒ ｂｔｗ ｒ ｎｏ ｌ ｄ ｉｅ ｔ ｔｏｇ ｕ ｓ ｔｅｅ－ ｅ ａ ｅ ｄｅｎ ａ ｔ ｉ （ Ａ ）ｏ ｉ ．Ｔ ｓ ｉ ｅｅ ａｄｍ ｙ ｉ ｄｄｉ ｏ ｗ ｏ ｐ： ｈ ｘ ｔ ｆｎ ｒ ｎ ａ ｅｅ ２ ａ ｓ ｂ ｂ ａ ｓ ｒ ｖ ｎ ｒ ｐｒ ｅｔ ｎ（ ｅ ｍ ｎ ｏｅｎ＝１）ａｄｔ ｏｔ ｌ ｎ（ ｉ ０ ｎ ｅｃｎ ｏ ｏｅ ｎ＝１） Ｓ ｓｉ ｕｅ ｅｅｌ ｅｅ ｉ ６ｄ ｄｎ－一ｈｎｌ — ｈ ｒ ０ ．Ｍ Ｃ ｄ ｃｄｗ ｒ ａ ｌｄｗｔ ４ 一ｉ ｉ ｏ２ｐ ｅｙ ｎ ｎ ｂ ｈ ｉ ｍ ｉ ｄｎ Ｄ Ｐ）ａｄａｔ ｅｏ ｓ ａｓｌｎｅ ｔ ｍ ｏａ ｉ ｆ ｃ ｏ ｅｅｐｒ ｎ ｒｕ ．Ｎ ｎｃｌｃ — ｏｅ（ Ａ Ｉ ｎ ｕ ｇｎｕｌ ｔ ｐａｔ ｉ ｏ ｙ ｒ ａ ｉ ａ ｔ ｎｉ ｔ ｘｅ ｍｅｔ ｏｐ ｏ—ｅ ｕ ｏ ｙｒ ｎ ｄ ｎ ｃ ｄ ｅ ｎ ｒｉ ｎ ｈ ｉ ｇ ｌｌ
诱导MSCs转分化为视网膜神经样细胞的应用
诱导M SC s转分化为视网膜神经样细胞的应用诱导MSCs转分化为视网膜神经样细胞的应用福建医科大学附属第一医院,福建省眼科研究所白月徐国兴庄华谢茂松郭健王婷婷[摘要]近年来，人们研究发现骨髓间充质干细胞（m esenchym al s t emcel l s,M SC s）在体外可经生长因子诱导，抗氧化剂诱导，中药诱导，增加细胞内cA M P等不同途径的诱导方法，分化为神经外胚层来源的神经元及神经胶质细胞，因此一些研究者尝试以上诱导途径使M SC s分化为视网膜神经样细胞，用于体内相关疾病的细胞替代治疗，为多种疾病带来了新的治疗思路。
[关键词]骨髓间充质干细胞体外诱导视网膜神经样细胞胚胎干细胞具有发育全能性，理论上可诱导分化为机体所需的任何组织或器官，但涉及伦理学问题，以往受到很大限制，发展缓慢。
应用眼色素上皮缘的视网膜干细胞[1]及鼠脑神经先祖细胞移植[2]也由于供体组织有限性及安全性问题，不利于治疗视网膜疾病的开展。
于是有人把目光投向成体干细胞中的MSCs，成年动物骨髓有2类干细胞群：造血干细胞和间充质干细胞。
最初因其容易贴壁呈成纤维细胞样克隆生长，被称为成纤维细胞集落形成单位（CFU-F）[3],后来研究发现它是骨髓造血微环境的重要组成部分，在体内外均具支持和调控造血的作用，且具有多向分化潜能，故又称其为间充质干细胞[4]。
也称为骨髓基质细胞[5]。
MSCs的特点为:①来源于中胚层，可以跨系统甚至跨胚层分化为3个胚层来源的细胞，特别是中胚层和神经外胚层来源组织的细胞（视网膜来源于胚胎期神经外胚层），并且经过20~30次细胞分裂后，这种分化特性也不会消失[6]。
②分离培养方便。
③由于不表达T细胞识别的细胞表面标志，植入后不会发生免疫排斥反应。
④易于转染和稳定高效表达外源基因优点[7],因此可把利于定向分化的生长因子基因转入MSCs，促使其定向分化。
MSC的纯化方法有贴壁筛选法，流式细胞仪分选法，密度梯度离心法，免疫磁珠法。
体外培养鼠骨髓间充质干细胞及其向心肌样细胞诱导分化的实验研究
法分 离培养的 ＭＳ ｓ生长稳 定 ， 殖较 快。经 ５氮胞苷诱 导后 ， Ｃ 形 态发 生变化 ， Ｃ 增 一 ＭＳ ｓ 可见肌管样结构 。免疫组化 和 Ｒ －Ｃ Ｔ Ｐ Ｒ证 实
采用贴壁 筛选 法 ， 简便 易行 ， 短期 内可获得 大量的纯度较 高的骨髓 间充质
干细胞 ； ５ 氮胞苷的诱导 下， 在 ． 骨髓间充质干细胞呈现 向心肌样 细胞 分化的趋势 。
和 ５氮胞苷效能 。方法 ．
线 ， 用流 式 细胞 仪 技 术检 测 Ｃ３９ Ｃ ４ 并 １ 、 Ｄ ５的 表 达 ， 行 细 胞 成 分 鉴 定 。 用 ５ 氮胞 苷 体 外 诱 导 ＭＳ ｓ观 察 其 形 态 结 构 。 用免 疫 组 ２ 进 一 Ｃ，
化检测肌钙蛋 白 Ｔ ｃ ｎ ） 结蛋 白（ ｅｍｎ ， Ｒ －Ｃ （Ｔ Ｔ 、 Ｄ ｓ ｉ） 用 ＴＰ Ｒ检 测心肌特异 因子基 因 Ｂ肌球蛋 白重链 （ － Ｃ 的表 达。结果 － ＢＭＨ ） ＭＳ ｓ Ｃ 经体外诱导发 生了向心肌样 细胞 的分化。结论
华
（ 中山大学第二附属 医院心胸外 科 ， 州市 广
【 摘要 】 目的
通过体外培养骨髓 间充质干细胞 （ Ｓ ｓ ， 用５ 氮胞苷诱 导其向心肌样细胞 分化 ， 究 Ｍ Ｃ 生物 学特 性 Ｍ Ｃ ）并 一 研 Ｓｓ
体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经干细胞分化的研究进展
32中西医结合心血管病杂志Cardiovascular Disease Journal of integrated traditionalChinese and Western Medicine2017 年 9月 C 第 5 卷第 27 期Sep. C 2017 V ol. 5 No. 27体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经干细胞分化的研究进展杜佳蕾，张曦元，万 娜，葛 斌，李 璐*（长春中医药大学，吉林长春 130117）【摘要】骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是一类多潜能细胞，在适当的条件下，能够通过诱导分化成为神经干细胞，在治疗神经系统方面的疾病具有良好的临床应用前景。
本文对BMSCs体外分离培养方法、诱导方法及治疗神经系统疾病的临床应用进行了综述。
【关键词】骨髓间充质干细胞；分离培养；诱导分化；临床应用；神经干细胞【中图分类号】R617 【文献标识码】A 【文章编号】ISSN.2095-6681.2017.27.32.02间充质干细胞（MSCs）具有自我复制能力属于多潜能细胞，主要存在于骨髓、脂肪、脐带、粘膜、肌肉、肺、肝、骨骼、胎盘、胰腺等，它在适宜条件下经过诱导可以向骨、脂肪、软骨等多种组织细胞分化。
而BMSCs属于间充质干细胞中的一种，因其自身具有取材对机体的损伤小，容易在体外进行分离、培养和扩增，回植体内后不会发生免疫排斥反应等特点而备受关注。
本文将从BMSCs 的分离培养、诱导BMSCs向神经干细胞分化的方法以及BMSCs对神经系统疾病治疗这三个方面加以介绍。
1骨髓间充质干细胞的的分离与培养将体外培养的BMSCs放置于倒置相差显微镜下观察，可以看到大多数的细胞呈梭形、纺锤形，少数形态表现为多角形，细胞核比较大，相邻的细胞之间有缝隙进行连接。
随着对BMSCs研究的不断深入，现在研究建立的用于分离提取BMSCs的方法有很多，比如贴壁细胞分离培养法、密度梯度离心法还有免疫磁珠法、流式细胞仪法等，但是其不同的培养方法所取得的效果不同。
人骨髓间充质干细胞体外成骨分化过程中成骨相关基因的动态表达
人骨髓间充质干细胞体外成骨分化过程中成骨相关基因的动态表达目的：系统研究人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）体外成骨诱导分化过程中成骨相关基因的表达变化。
方法：应用密度梯度离心法分离hBMSCs，取第2代细胞通过流式检测及多向诱导分化方法进行干细胞鉴定；应用RT-PCR法对hBMSCs在体外成骨诱导不同时间点的成骨相关基因表达进行检测。
结果：第2代hBMSCs表达间充质干细胞表面标志CD44、CD90，具有成脂和成骨分化潜能。
成骨相关基因在诱导早期部分表达，中期均有表达，基因表达大部分在14天达高峰，与矿化相关的基因表达在21天达高峰。
结论：hBMSCs体外成骨诱导过程中成骨相关基因呈动态表达，其表达时序与成骨细胞生理发育基本相似。
Abstracts:ObjectiveTo investigate the osteogenic related genes expression during in vitro osteogenic differentiation of human bone mesenchymal stem cells (hBMSCs).MethodshBMSCs were isolated by density gradient centrifugation. Surface markers and cell cycle were analyzed by flow cytometry. The multiple differentiation potential of hBMSCs were identified using in vitro osteogenic and adipogenic induction. The osteogenic related genes expression of hBMSCs at different induction time point were evaluated by semiquantitative RT-PCR analysis.ResultsThe hBMSCs were derived from bone marrow and expressed CD44 and CD90, markers of mesenchymal stem cell. The second passage of hBMSCs showed adipogenic and osteogenic differentiation potential. During the osteogenic induction process,hBMSCs expressed part of osteogenic related genes in early stage, and all of them in middle stage.The peak expression of most of genes were on the 14th day, and the mineralization associated genes on the 21st day. ConclusionsThe osteogenic related gene expression of hBMSCs shows a dynamic progress during in vitro osteogenic induction, which is consistent with in vivo development of osteoblast.Key words:hBMSCs;in vitro differentiation;osteogenic genes;expression pattern骨缺损的修补和重建是修复重建外科临床面临的常见问题。
成人骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化为神经元样细胞的研究
Ａ ，哺ｃ： ｂｅ￣ ｅ ｏｓ ｄ ｅｐｔ ｔｌ ｆ ｅｒｌ ｉｅｅ ｔ ｎｏ ｕ ａ ｎ ｅ ｎｈｆ ｌ ｔ ｄｓＭｅｉ ｓ ｌ 劬 ｔＯ Ｊ ｖ Ｔ ｕｙｔ ｏ ｎ ａ ｏ ｎｕ ｆ ｒ ｅ ｔ ｈ ｅ ｉ ａｄ ＢＯ ｆ ｍ ｎｂ ｅｒ ｓ ｃⅥｌ ｅ ｃ ｌ ｉ ｈ ｏ ｎｅ Ｉ Ｓｍ ａ ． ｎ ａｌ
ｉ ｌ 姒 捣 ａｄｄ ｔｃｅ ｅｉ ｎＩｑ Ｉ ｎ ｅｅｔｄｔ 一 ｈ
０Ｉ 口 ｅ ｐｅｓｏ ｆｎ ｒｅｃｌ ｙｉ ｕ ｏｌ ｃ ｅ １ ｓ ｉｉｇａ ｄ Ｒ － Ｒ． ｝ Ｉ Ｗ ｅ ｎ ｄｈｇ ｏｌ ｎ ｌ ｒ腿 ｘ ｒｓｉｎｏ ｅｖ ｅｌ ｂ ｓ 唧 ｎ ｝咖 ｈ Ｈｉ ｉ ８ ｔ ｎｎ ｎ Ｔ Ｉ ａ ￣ ＲＩ 缸 鲺ｔ ｅ ｉｈ ｈ ｎ ￣ ｏｌ ８
维普资讯
・—
－—
—
４ ・— － —
Ｃ ｉ Ｊ ｉ ，虮ｕ ｒ。 ０ ７ Ｖ １ １ Ｎ ． ｈｎＪＩ ｂ Ｄ唧 Ｊ ａｙ２ ａ ， ０ １ ， ｏ １ ａ
文章 编号 ： ０ 一４８ （Ｏｒ Ｏ —００ —０ １ ＂ ２７２ ｃ ）１ ０４ ４ ０／ ７
ｅｌｉ ｕ ｔ ， ＭＳ ｎ Ｈ ， 蛐 ｕｅ ａ ｅｏ Ｄ Ｏ ａｄ Ｂ Ａ ｗ ￣ｔ ｒ ｓｄｔ ｏ ｄｆ ｒ￣ ｉｅｅ ｏ ｆＭＳ Ｂ Ｗｅｏ ｓｒｅ ｅ ｎ ０ Ｃ ． ｂｅ ｖｄ ｔ ｈ
ｗ ｒ ｉ ｌｅ 。ｕｕｅ ｎ ｒｉｒ ｅ ｙ ｅ ｏ ｒｄ ｎ ｎｒ ｉｎａｄａｈ施ｌ ｌ ｔ ａｋｃｌ ｒ．Ｆ Ｆａｄｔｅ ｌ ｌ ｅ ｏ ｔ ｃｌ ｒｄａｄｐ ｌｅ ｔ ｂ ｒ ｌｇａｉ ｔ ｅｔ￣ ｏ ｅ ｃ ｔ ｐ ｓｃｆｓ ｕ ｕ Ｂ Ｇ ￣ｌ ｅ ｓａ ｄ ｔ ｏｆ ｄ Ｐ ｅｌ ａ ｅ ｅ ｈ ｎ ｄ ｅｏ ａｉｌ ｔｅ ｎ ｈＣ ｉ －
体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞表达酪氨酸羟化酶
体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞表达酪氨酸羟化酶陈丽;井绪东;何冬梅;张洹;房宝英【期刊名称】《暨南大学学报（自然科学与医学版）》【年(卷),期】2007(028)006【摘要】目的:探讨体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)表达酪氨酸羟化酶,为帕金森病细胞移植替代治疗提供特异性分化的细胞.方法:在无菌条件下从SD大鼠的股骨中分离骨髓间充质干细胞,体外培养传3代后,用表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和抗坏血酸诱导MSCs 表达酪氨酸羟化酶.在镜下,观察MSCs 在诱导前后的形态变化;用免疫荧光染色检测酪氨酸羟化酶的表达.结果:MSCs经诱导分化后,胞体逐渐变圆,并伸出神经轴突、树突样突起;免疫荧光化学表明细胞酪氨酸羟化酶染色呈强阳性反应.结论: SD大鼠骨髓间充质干细胞在体外能被定向诱导表达酪氨酸羟化酶,有可能为帕金森病治疗提供特异性分化的细胞.【总页数】4页(P562-565)【作者】陈丽;井绪东;何冬梅;张洹;房宝英【作者单位】暨南大学医学院血液研究所,广东,广州,510632;暨南大学医学院血液研究所,广东,广州,510632;暨南大学医学院血液研究所,广东,广州,510632;暨南大学医学院血液研究所,广东,广州,510632;暨南大学医学院血液研究所,广东,广州,510632【正文语种】中文【中图分类】R575【相关文献】1.HLA A表达沉默和酪氨酸羟化酶过表达的人成纤维细胞脑内移植治疗帕金森病大鼠模型 [J], 梁彩霞;徐云智;赵春礼;郑德宇;段德义2.BMP-2,BGP mRNA表达量及ALP活性的变化对大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导成骨细胞的影响 [J], 娄鸣;李晓红;饶国洲3.成纤维生长因子-2联合骨形态发生蛋白-2体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化 [J], 孙微;王海萍;吕洋;李柔;陈晓依4.血管紧张素Ⅱ体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞心肌样细胞分化研究 [J], 邢玉洁;朱火兰;朱舜明;张荣怀;崔倩卫;刘小祥;王军奎5.大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导后对糖尿病大鼠模型的治疗作用 [J], 刘阁玲;路一芳;李伟娟;肖红珍;俞芳;项岫秀;张慧芹;刘秀玲;石艳平因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
体外诱导骨髓问充质干细胞分化移植治疗脱髓鞘大鼠的实验研究
１ ． ３ 模 型建立
ｅ ｌ ｌ ｓ ／ ｌ 备用 ［ ３ － ４ ］ 。 大 鼠脊髓匀浆与弗 氏完全佐剂 （ Ｃ Ｆ Ａ）混合 ｃ １ ． ５ 移植治疗 治疗组 Ａ、Ｂ 、ｃ大 鼠给予少突胶质细胞移植
治疗 ，少 突胶质 细胞 移植 前 １ 天至实验结束 每 日给予环孢素
１ ． ２ 仪 器与试 剂
Ｓ Ｉ ＧＭＡ ２ — １ ６型 水 平 离 心 机 （ Ｓ ｉ ｇ ｍ ａ公
司） ，Ｃ Ｏ 培养箱 （ Ｈ ｅ ｒ ａ ｅ ｕ ｓ 公司 ） ，多通 道 电生 理 检 测 仪 培养 ，并用 ０ ． 叭 ｍ ｏ ｌ ／ Ｌ Ｐ Ｂ Ｓ清洗生 长面数次 。加入 ０ ． ２ ５ ％ 胰 （ 澳大利亚 Ｐ ｏ ｗ ｅ ｒ ｌ ａ ｂ） ，青 霉素 一链 霉 素、胎 牛血 清 （ 美 国
并体现 出剂量依赖性 。结论 ：体外诱导骨髓 间充质干细胞分化移植治疗脱髓鞘大 鼠效果较好 ，为 临床研究提供科学依据 。 【 关键词 】 骨髓间充质干细胞 ； 脱髓鞘大 鼠； 移植治疗
ｄ ｏ ｉ ： １ ０ ． ３ ９ ６ ９ ￣ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ． １ ６ ７ ４ — ４ ９ ８ ５ ． ２ ０ １ ３ ． １ ２ ． ０ ０ ７
作 为抗 原佐剂乳化物 。大 鼠麻 醉后 仰卧 ，开腹 ，开胸 ，剪断
胞 ，胰 酶消化后 ，离心加 入诱 导液转移至含有盖玻片的培养
１ ． １ 实验 动物
选择 ５ ０只成年雄 性大 鼠，随机 分五组 ，每
组 ｌ ０只 ，分 别为 对照组 、模 型组 、治 疗组 Ａ（ ０ ． ０ ２ Ｉ ｔ ， ｌ ／ ｇ ） ，
组 Ｂ（ ０ ． ０ ４ １ ／ ｇ） ，组 Ｃ （ ０ ． ０ ８ １ ／ ｇ ｏ
增强型绿色荧光蛋白标记骨髓间充质干细胞体外诱导分化成心肌样细胞研究
Ｃ ｌＲ ｓ２０ ，０ ４ ：５ － ６ ． ｅｌ ｅ ，０ １ １ （）４ １４ ３
细胞 仪检测 ＩＡ病尿 ＮＫ细胞含 量可间接反 映 出 Ｉ Ｓ ｇ ＡＮ肾小
球病 变程 度 。 协助判断 ＩＡ肾病患者的预后 ， ｇ 是一种具有较好 应用价值 的非 创伤性检测 手段 。 参 考 文 献
的差异较大 。 这可能 与肾活检 以及 观察 病例的人选标 准 以及 观察时间不 同有关 。本研究 利用 Ｆ Ｍ技术 发现 ：随着 ＩＡ Ｃ ｇＮ
Ｎｅｈｏ，９ ８４ （ ） １ ８ ｐ ｒｌ１９ ，９ １ ：－ ．
４ 陈香美 ， 院生．ｇ 谢 Ｉ Ａ肾病 的发病与治疗 ． 中西 医结合 肾病 中国
以便确定转染浓度对转染 效率的影响，并 明确经蛋 白标记后
特 异性肌钙蛋 白 Ｔ ｃｎ ） 克隆抗体 、Ｄ １ （ Ｔ单 Ｔ Ｃ ３ 单克 隆抗体 、 连
接蛋 白 ４ ３多克隆抗体 （ 国 Ｇｂ ｏ 司） 横纹肌肌动蛋 白 美 ｉｃ 公 ； 一
是理想 的种 子细胞和基 因转移 的载体细胞 ． 但其在 体内 的转
归是研究 的难点 『。近期 ， ２ １ 我们采用不 同浓度 的转染 液转染 ，
１ 林宜 ， 朱斌 ， 军等．ｇ 王 Ｉ Ａ与非 Ｉ ｇ Ａ系膜增 生性肾炎患者外周 血
７ 任野平 ， 长宏 ， 赵 刘素雁 ， 慢 性肾炎 患者红细 胞免疫 与 Ｎ 等． Ｋ
细胞 活性 的相关 性 ． 中华 微 生物学 和 免疫 学杂 志 ，０ １２ ２０ ，１
（ ）６ ． １ ：９
ｉ ｌｃ ｔ ｎ ｏ ｈ ｒ ｐ ｆｈ ｍａ ｉｅｓ ． Ｊ Ｈｅ ｔｔｅ ｔｍ ｍｐ ｉａｉ ｓ ｆｒ ｔｅａ ｙ ｏ ｕ ｎ ｄｓ ａｅ ｏ ｍａｏｈ ｒ Ｓｅ
人骨髓间充质干细胞诱导分化为RPE样细胞的探讨
1 材料与方法
1. 1 材料 DMEM-LG 培养基、胰蛋白酶、胎牛血清（Hyclone, USA）；
bFGF、EGF、BDNF、PEDF(Peprotech,US A)；Taurine（Sigm a,US A）； 淋巴细胞分离液（天津市灏洋生物制品科技有限责任公司）； 小鼠抗人巢蛋白单克隆抗体、小鼠抗人角蛋白 8＆18 单克隆抗 体、小鼠抗人 RPE65 单克隆抗体（NeoMarkers，USA）；流式 细胞术试剂小鼠抗人单抗 CD34-FITC+小鼠抗人 CD90-PE，小 鼠抗人单抗 CD34-FITC+小鼠抗人 CD44-PE（Beckman-Coulter， USA）, RT-PCR 试剂盒（Fermentas，USA），transwell 双层共 培养 系统（Corning，US A）。 1. 2 方法 1.2.1 骨髓的采集、BMSCs 的分离与培养
RPE65 蛋白检测：收集细胞爬片进行 RPE65 蛋白的免疫 细胞化学检测：PBS 洗涤，4%多聚甲醛固定，5%正常羊血 清封闭，加入小鼠抗人 RPE65 蛋白单克隆抗体（稀释度为 1： 100），4℃过夜，滴加聚合物辅助剂及生物素化山羊抗小鼠 IgG， DAB 显色及苏木素复染，自来水洗涤后干燥，树脂封 片，显微镜下观察，拍照。 1.2.5 诱导分化
骨髓间充质干细胞体外诱导分化为神经元的理论研究现状
J
o u rn a
第
T is
73
孝 夥
E
n
70
， 铹
‘
2009
e s e a rc
—
03
h
—
0 5 出版
rc
l
o
f C li n i c
a
l R
e
h a b ili t a t i v
e
s u e
g in
e e r in
g R
Ma
h 5
．
2 009
V0 1 1 3
t ia t io n t
J ia
g S t u d y Jn g f o
n re e
，
g Yo
n
—
c
he
n
~
te
． ’
r m a s o n in rs
r s
de g J in
z
L ia
g
it y ,
o u tc o m e s
m a n
y
u n c e rt a
i n t ie
de
s e w e
s u c
n e u ra
I
c e
l ls
．
B MS Cs
c a n
—
be
d
a s
a
c e
ll
s o u rc e
v e
fo
r o rg a n s u
n
c o n s
t r u c t io n o
c e
r c e
ll r e p a i r
体外三维培养骨髓间充质干细胞诱导分化为肝细胞及其极化特征
体外三维培养骨髓间充质干细胞诱导分化为肝细胞及其极化特征卫金花;曲强;杨阳;何小东;刘卫【期刊名称】《基础医学与临床》【年(卷),期】2012(032)006【摘要】目的探讨体外三维诱导培养体系下人骨髓间充质干细胞向肝细胞分化及极化特征.方法从成人骨髓中分离出骨髓间充质干细胞(BMSC),利用胶原蛋白三维培养体系进行体外诱导培养.用HE染色法观察分化肝细胞的形态及结构特征,用免疫组化法检测肝细胞特异性蛋白的表达,用免疫荧光法检测极化蛋白BSEP和SRBI 的表达特征.结果成人BMSC在体外胶原蛋白三维诱导培养体系中呈多层排列生长,形成细胞间紧密连接及管状结构.BMSC分化来源肝细胞特异性表达ALB及AFP.肝细胞极化蛋白BSEP和SRBI在肝细胞呈特征性分布.结论 BMSC在体外胶原三维培养体系中可诱导分化为肝细胞,并形成肝组织特征性的极化结构.【总页数】5页(P639-643)【作者】卫金花;曲强;杨阳;何小东;刘卫【作者单位】中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院基本外科,北京100730;中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院基本外科,北京100730;中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院基本外科,北京100730;中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院基本外科,北京100730;中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院基本外科,北京100730【正文语种】中文【中图分类】R318.14【相关文献】1.大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化为肝细胞 [J], 王忠琼;李昌平;夏世萍;刘彦;钟晓琳2.大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化为肝细胞 [J], 王忠琼;夏世萍;刘彦;钟晓琳;李昌平3.骨髓间充质干细胞向肝细胞的体外诱导分化 [J], 钟晓琳;王忠琼;万居易;李昌平4.骨髓间充质干细胞体外诱导分化为肝细胞的研究与进展 [J], 罗伟;肖恩华5.大鼠骨髓间充质干细胞向类肝细胞体外诱导分化 [J], 何文艳;刘树贤;姜慧卿因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
BMSCs体外培养与向神经元样细胞诱导分化的进展
骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells ，BM -SCs ）是来源于骨髓组织中的非造血细胞，具有来源容易获取、不受伦理限制，广泛的增殖分化能力，易于分离、培养、扩增、纯化，免疫原性弱，免疫耐受性强，体外基因转染率高，并能稳定高效的表达外源基因等优点。
因此，BMSC 成为一种比较理想的种子细胞，BMSC 由于能向神经细胞这种几乎不可再生细胞的分化能BMSCs 体外培养与向神经元样细胞诱导分化的研究进展彭立军，羊明智（南华大学附属第一医院脊柱外科，湖南衡阳421001）【关键词】间质干细胞；骨髓；神经元；诱导分化文章编号：1009-5519（2012）09-1359-04中图法分类号：R322.8文献标识码：A力，更是成为研究的热点。
近年来BMSCs的体外诱导向神经元样细胞分化的方法和可能的机制取得了很多新的进展和成果，本文就BMSCs体外培养诱导向神经元样细胞分化的进展作一综述。
1骨髓间充质干细胞（BMSCs）1.1BMSCs的发现1867年，德国病理学家Cohnheim在研究创伤愈合时，将一种不溶性的染料注入静脉，结果在损伤部位发现含有这种染料的细胞，这些细胞绝大多数来源于血液，因此Cohnheim推断出骨髓中可能存在非造血组织干细胞的观点。
1968年，Fridenstein等[1]研究发现并提出在骨髓中存在一种成长棱形类似成纤维细胞形态，培养时呈克隆生长，能贴附塑料培养瓶生长，能形成成纤维细胞集落形成单位（colony-forming units fi-broblastic，CFU-F），并将之称为骨髓多能基质干细胞（marrow pl uri-potent stromal stem cells）。
1991年，Caplan将它命名为骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）。
最近有研究表明，全身结缔组织和间质中也存在BMSCs，而以骨髓组织中含量最为丰富。
骨髓间充质干细胞的分离分化及研究进展
骨髓间充质干细胞的分离分化及研究进展摘要：骨髓间充质干细胞是存在于骨髓基质中的非造血系细胞，它们能够分化成中胚层和非中胚层细胞。
骨髓间充质干细胞主要有4种体外分离方法：贴壁筛选法，密度梯度离心法，流式细胞仪分离法和免疫磁珠分离法。
由于骨髓间质干细胞具有多方面的优势,越来越受到人们的关注，研究也越来越深入。
本文从来源、形态、体外分离培养及应用前景几个方面做一综述，为相关研究提供参考。
关键词：骨髓间充质干细胞；分离培养；分化骨髓由造血组织和基质构成，近年的研究表明，在骨髓基质中存有间质干细胞(me5enchyma15temcel15，MSCS)，骨髓原始间充质干细胞是骨髓基质干细胞，对骨髓中的造血干细胞（HSC）不仅有机械支持作用，还能分泌多种生长因子（如IL-6，IL-11，LIF，M-CSF及SCF等）来支持造血，体内外实验已证明它具有多向分化潜能，在一定的诱导条件下MSCS具有向成骨细胞、成软骨细胞、成肌细胞、肌键细胞、脂肪细胞等中胚层细胞分化的能力。
因此它已成为医学界近来研究的热点，但骨髓中MSCS含量很少,每1万～10万个单核细胞中大约有1个MSCS,难以满足实际应用的需要，因此体外分离纯化MSCS,研究其培养特性，获得大量稳定的MSCS具有重要的理论意义和现实意义。
1. 骨髓间质干细胞的来源在生物个体的发育过程中先后出现胚胎干细胞和成体干细胞,具有多向分化潜能的间质干细胞作为一种成体干细胞来源于中胚层间充质,主要存在于全身结缔组织和器官间质中,以骨髓组织中含量最为丰富,在人的骨髓中约占单个核细胞数的1/1×105[1]。
间充质干细胞是一类贴壁基质细胞，可以向间质组织分化，包括骨组织，软骨组织，脂肪组织。
目前研究较多的间质干细胞主要来源于脐带血、外周血及脂肪组织。
MSCS的获得主要来自于骨髓的抽吸，人类MSCS一般从髂前上棘吸取，也可从胫骨、股骨、胸骨、腰椎等骨中获取，大动物MSCS的获取部位与人类相同，兔需抽取中段胫骨或股骨的骨髓。
人骨髓间充质干细胞的分离、培养和体外定向诱导成类软骨细胞的实验研究
２ １ １ 原 代培 养 ： ． ． 骨髓 单 个 核 细胞 刚接 种 时 ， 细胞 分散 ， Ｃ ＭＳ ｓ与周 围 的血 细胞 相 混 杂 ， 易 区 分 。骨 不 髓 单 个 核 细胞 接 种 ３ｄ ， 壁 ＭＳ ｓ的形 态 逐 渐延 ，贴 Ｃ 伸 成 梭形 ， 即成 纤 维样 细 胞 。８ｄ后 ， Ｃ ＭＳ ｓ进 一 步 伸展 、 增殖 ， 见 ＭＳ ｓ 成 集 落 ， 可 Ｃ 形 随着 集 落 不 断扩 大， 细胞呈放 射状 向周 围扩 展 ， 逐渐 与 邻近 集 落 相汇
—
ｐ ／ 转 铁 蛋 白、 霉 素 １ ０ｐ ｍｌ 链 霉 素 １ ０ ／ ． ｍｌ ｇ 青 ０ ． 、 ／ ０
ｍ１诱 导第 二代 、 四代 、 ） 第 第六 代 ＭＳ ｓ 在倒 置 显微 Ｃ， 镜下 观察均 比较 相 似 ， 导 １ ， Ｃ 变 成 圆形 或 诱 ４ｄ ＭＳ ｓ
多边 形 ， 清晰 ， 核 核周 可见 密集 的黑 色颗 粒 。对 照组 ＭＳ ｓ 明显改 变 。 Ｃ 无
结 论 不 同代 的 ＭＳ ｓ 导 率 无 明 显 差异 ； ＧＦ 浓 度 为 ５ｎ ／ 组 Ⅱ型胶 原 弱 阳 性 ， 适 合 作 为 组 Ｃ 诱 Ｔ 一８ ｇ ｍｌ 不
织 工 程 种 子 细胞 ； 导软 骨 Ｔ 一目 最 适 浓度 为 １ ｇ ｍｌ２ ｇ ｍｌ 诱 ＧＦ ０ｎ ／ 、０ ／ ｎ 【 键 词 】 人 骨髓 间 充质 干 细胞 生 物 学特 性 分 化 关 软 骨 ＴＧ 一口 Ｆ
化成 软骨 细胞 ， 为组 织工程 提供 软骨 种子 细胞 。
１ 材 料 与 方 法 １ １ 材料 ．
２１２ 传代培养 ： ．． 刚传 代 的 细胞 呈 圆形 ， 很快 贴 壁
逐 渐 变 成 长 梭 形 ， 壁 细 胞 均 匀 分 布 ， 态趋 于 同 贴 形
体外诱导骨髓间充质干细胞向上皮样细胞分化
体外诱导骨髓间充质干细胞向上皮样细胞分化王亚菁;孙兆瑞;陈昶;吴涛;徐婧;韩晓冬【期刊名称】《实用老年医学》【年(卷),期】2009(23)4【摘要】目的通过体外气-液界面共培养的方法,诱导兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)向上皮样细胞分化.方法贴壁分离法体外培养BMSCs,pMSCV/GFP逆转录病毒转染BMSCs,使BMSCs成功表达绿色荧光蛋白.同时两步酶消化法(Pronase酶和胰酶)体外培养兔气管上皮细胞(RTEs),Cytokeratin18(CK-18)单克隆抗体鉴定.建立气-液界面培养模型,将标记有GFP的BMSCs和RTEs以一定比例混匀接种到套皿内,连续共培养14d,CK-18免疫荧光染色鉴定分化结果.结果荧光显微镜下,pMSCV/GFP逆转录病毒转染BMSCs呈现明显的绿色荧光,同时共培养后部分标记有GFP的BMSCs经CK-18荧光染色,呈现红色荧光,说明经GFP标记的BMSCs已被成功诱导分化成气管上皮.结论体外气-液界面条件下,兔BMSCs与原代培养兔RTEs共培养可以成功诱导分化为上皮样细胞,表达上皮特异性角蛋白CK-18,为BMSCs作为组织工程化气管的种子细胞奠定实验基础.【总页数】4页(P261-263,封2)【作者】王亚菁;孙兆瑞;陈昶;吴涛;徐婧;韩晓冬【作者单位】210093,江苏省南京市,南京大学医学院免疫与生殖生物学实验室,江苏省医学分子技术重点实验室;210093,江苏省南京市,南京大学医学院免疫与生殖生物学实验室,江苏省医学分子技术重点实验室;200433,上海市,上海市肺科医院胸外科;210093,江苏省南京市,南京大学医学院免疫与生殖生物学实验室,江苏省医学分子技术重点实验室;210093,江苏省南京市,南京大学医学院免疫与生殖生物学实验室,江苏省医学分子技术重点实验室;210093,江苏省南京市,南京大学医学院免疫与生殖生物学实验室,江苏省医学分子技术重点实验室【正文语种】中文【中图分类】R542.2【相关文献】1.体外诱导人羊膜上皮细胞分化为角膜上皮样细胞的初步研究 [J], 姚敏;陈剑;王文娟;张晓玲;杨筱曦;周清;徐锦堂2.体外诱导人骨髓间充质干细胞向色素上皮样细胞分化的研究 [J], 安刚;路璐;许苑;洪晶3.体外诱导骨髓间充质干细胞向胆管上皮样细胞分化 [J], 张诚;杨玉龙;林美举;史力军;张洪威;李婧伊;4.体外诱导骨髓间充质干细胞向胆管上皮样细胞分化 [J], 张诚;杨玉龙;林美举;史力军;张洪威;李婧伊5.体外诱导犬骨髓间充质干细胞向上皮样细胞分化的初步研究 [J], 韩桂林;丁芳宝;梅举;黄盛东;龚德军;刘晓红;刘艳玲因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
全骨髓贴壁法培养兔骨髓间充质干细胞体外定向成骨诱导分化及鉴定
（ ２ ０ １ ３ ） ０ ６ — ０ １ ０ ６ ９ － ０ ６
收稿 日期：２ ０ １ ２ ． ０ ５ ． １ ９
修回日 期 ：２ ０ １ ２ ． ０ ６ ． １ ６
【 ２ ０ １ ２ ０ ３ １ ９ ０ ２ ３ ／ Ｗ‘ Ｃ）
／ ｎ ｖ ｉ ｔ ｒ ｏ ｏ ｓ ｔ ｅ ｏ ｇ ｅ ｎ ｉ ｃ ｄ ｉ ｆ ｅ ｒ ｅ ｎ ｔ ｉ ａ ｔ ｉ ｏｎ ａ ｎ ｄ ｉ ｄ ｅ ｎ ｔ ｉ ｆ ｉ ｃ ａ ｔ ｉ ｏｎ ｏ ｆ ｒ ａ ｂ ｂｉ ｔ ｂ ｏｎ ｅ ｍａ ｒ ｒ ｏ ｗ
方法 ：采用 全骨 髓贴 壁法 体外 分离 培养 兔骨 髓 间充质 干 细胞 ，倒置 显微 镜下 观察 细胞 形态 学特 征 。在成
科大学第一附属 医院创伤 手 外 科 ，广 西壮 族 自治 区
南 宁市 ５ ３ ０ ０ ２ １
ｗ ｅ ｊ ｑ ｉ ｎ ｇ ｊ ｕ ｎ ｇ ｘ ｎ ｎ ＠
１ ６ ３． ｃ ｏｍ
ｄ ｏ ｋ ｌ Ｏ ． ３ ９ ６ ９ ／ ｊ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ． ２ ０ ９ ５ － ４ ３ ４ ４ ． ２ ０ １ ３ ， ０ ６ ． ０ ２ ０ 中国组织Ｉ程磷究 ． ２ ０ １ ３ ，１ ７ （ ６ ） ： １ ０ ６ ９ － １ ０ ７ ４ ，
ｍｔ ｌ ｐ ： ｆ Ｗ ｗ ｗ ． ｃ ｒ 【 ｅ ｒ ｏ 固 １
中图分类号： Ｒ ３ ９ ４ ２ 文献标识码： Ｂ 文章编号： ２ ０ ９ ５ － ４ ３ ４ ４
骨诱 导剂 作 用 下 ，通 过 碱 性 磷 酸 酶 染色 试 剂 盒 行 碱 性 磷 酸 酶染 色 ， Ｉ型胶 原 免 疫 细 胞 化 学 染 色 ，Ｙ ｏ ｎ Ｋ ｏ ｓ ｓ ａ法 及 茜素 红进行 矿化 结节 染色 以及 电镜 下 检测 兔骨髓 问充质 干细 胞成 骨诱 导 后 的形态 结构 。 结果 与结 论 ： 经诱 导后 细胞 出现 与成 骨细 胞相 似 的形态 学特 征 ， 碱 性磷 酸酶 染色 阳性 ， Ｉ 型胶 原 免疫 细胞 化 学染 色 ， Ｙ ｏ ｎ － Ｋ ｏ ｓ ｓ ａ法 及茜 素红 矿化 结节 染色 阳 性 。 表 明经 成骨 诱导 剂 诱导 后全 骨髓 贴壁 法体 外分 离 纯化 培养 的兔骨 髓 间充 质干 细胞 能 向成 骨 细胞 方 向分化 增殖 。
人骨髓间充质干细胞诱导分化为汗腺细胞的实验研究
人骨髓间充质干细胞诱导分化为汗腺细胞的实验研究蔡飒;赵安东;李海红【期刊名称】《汕头大学医学院学报》【年(卷),期】2010(23)4【摘要】目的:研究人骨髓间充质干细胞(hMSCs)在体外诱导分化为人汗腺细胞(hSGCs)。
方法:体外分别分离培养hMSCs和hSGCs,原代培养hSGCs融合后,收集细胞,制备汗腺细胞匀浆,用含10%汗腺细胞匀浆的汗腺培养基来诱导培养hMSCs。
1周后,检测诱导培养的hMSCs的抗原表达。
结果:培养的hSGCs表达CK19和CEA;hMSCs表达CD44、105,不表达CK19、CD34和CEA。
诱导培养1周,免疫细胞化学染色示诱导培养组少量细胞表达CEA和CK19,而对照组未见CEA和CK19阳性细胞;流式细胞仪检测CEA在诱导培养组的阳性表达率约为(6.2±1.2)%,对照组(0.9%±0.0)%(P<0.05)。
结论:在无完整汗腺细胞存在的情况下,hMSCs在体外也可诱导分化为hSGCs。
【总页数】4页(P224-226)【关键词】人骨髓间充质干细胞;汗腺细胞;诱导;分化【作者】蔡飒;赵安东;李海红【作者单位】深圳大学医学院组织学与胚胎学教研室;汕头大学医学院第二附属医院烧伤外科【正文语种】中文【中图分类】R64【相关文献】1.5-氮胞苷与HGF因子体外联合诱导人骨髓间充质干细胞诱导分化为心肌样细胞实验探讨 [J], 银广悦;陈素萍;王文红;张继领;张龙;张明2.人骨髓间充质干细胞体外诱导分化为胰岛素分泌细胞的实验研究 [J], 贾海燕;肖竹;龙洋;张翔迅;田浩明3.人骨髓间充质干细胞诱导分化为汗腺样细胞过程中microRNA表达谱差异的分析 [J], 陈艳;赵洪良;谭志军;赵焕军;张翠萍;付小兵4.人骨髓间充质干细胞诱导分化为内皮细胞的实验研究 [J], 冯德广;张凯伦;余海彬;徐成阳;李红卫;初佩俊5.肝细胞生长因子联合成纤维细胞生长因子-4诱导人骨髓间充质干细胞分化为肝样细胞的实验研究 [J], 谢金敏;陈建锋;高毅因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
骨髓间充质干细胞体外诱导分化与标记(一)
作者：吴晓林,李冬民,马德茂,张晓田,黄石,宋天保
【关键词】骨髓
【Abstract】AIM:Tostudythedifferentiationcharacteristicsandtheoptimaldosageandtimingforbromodeoxyuridi ne(Brdu)labelingofratbonemarrowderivedmesenchymalstemcells(MSCs)invitro.METHODS:Therat marrowstemcellsisolatedbyusingPercoll(1.073kg/L)wereculturedandproliferated.Thethirdpassage cellswereinducedwithdexamethasome,βglycerophosphate,ascorbicacid2phosphate,IGF1andinsuli n.Onday21,thecellswereanalyzedbyimmunohistochemistryfortypeⅠcollagenandbyhistochemistry foralkalinephosphatase(AKP).ThepurifiedMSCswereincubatedwithBrduatdifferentconcentrations( 5,10and15μmol/L)fordifferenttimeperiods(12，24，48，72and96h),followedbyimmunohistochemistryforBrdutoidentifytheoptimalBrduconcentrationandi ncubationtimeperiod.RESULTS:Afterincubationfor21dforinduceddifferentiationintoosteoblasts,ty peⅠcollagenandAKPwerepositivelyexpressed.Theincubationwith10μmol/LBrdufor72hachievedov er98%ofthelabelingratewithoutproducingobviouscelldamages.CONCLUSION:MSCscanbeinducedt odifferentiateintoosteoblastsundercertainconditionsinvitro.TheoptimalBrdulabelingconcentration andtimeperiodare10μmol/Land72h,respectively.
【Keywords】MSCs;induceddifferentiation;osteoblast;Brdu
【摘要】目的：探讨骨髓间充质干细胞（MSCs）在体外的诱导分化及5溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)标记MSCs的可行性.方法：利用密度为1.073kg/L的percoll分离骨髓的单个核细胞，体外培养与扩增MSCs；取生长良好的第3代细胞，用成骨细胞分化培养液培养21d，Ⅰ型胶原免疫组化染色和碱性磷酸酶（AKP）组化染色；分别以浓度为5，10和15μmol/L的Brdu溶液标记MSCs，孵育12，24，48，72和96h后免疫组化检测Brdu，确定最佳标记量和最佳标记时间.结果：诱导分化第21日,AKP染色呈强阳色,Ⅰ型胶原免疫染色呈阳性.10μmol/LBrdu 标记MSCs的效果最好，随着孵育时间的延长，Brdu标记率逐渐增高，标记72h后标记率在90%以上.结论：MSCs在体外一定条件下可定向诱导分化为成骨细胞，用Brdu标记MSCs的最佳浓度为10μmol/L，最佳时间是72h.
【关键词】骨髓间充质干细胞；诱导分化；成骨细胞；5溴脱氧尿嘧啶核苷
0引言
骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)是一类具有多向分化潜能的组织干细胞.因MSCs取材方便、对机体的损伤小、具有较强的传代增殖能力和免疫耐受性等特点而受到越来越多的关注.本实验的目的是利用MSCs具有分化潜能的特点，在体外诱导该细胞定向分化为成骨细胞.并用Brdu标记连续传代的MSCs，观察最佳标记时间及标记剂量，从而为追踪Brdu标记的MSCs移植入体内后的存活、生长及分化奠定基础.
1材料和方法
1.1材料健康雄性SD大鼠，体质量55～70g.由西安交通大学医学院实验动物中心提供.
1.2方法
1.2.1大鼠骨髓MSCs的体外分离培养将大鼠引颈处死后置于750mL/L乙醇浸泡约5min，无菌条件下分离出大鼠的股骨和胫骨.用PBS冲洗出骨髓细胞，经5mL针管反复吹打制成单细胞悬液，用200目的不锈钢网过滤，收集滤液.在密度为1.073kg/L的percoll（Phamacia）分离液上缓慢加入收集的滤液，2500r/min离心20min，收集滤液与分离液之间的白膜层细胞，用DMEM（Gibco）洗涤两次，1000r/min离心5min.用加有100mL/L胎牛血清（杭州四季青公司）的DMEM重悬细胞，1×108个/L种于两个直径为6cm的培养皿中培养，2d后更换培养液，加入完全培养基.并将吸出的旧培养液分别移入另两个平皿中继续培养，再过2d更换
成完全培养基.以后每3～4d换液1次，弃去没有贴壁的悬浮细胞.待细胞生长融合到约80%，用0.2g/LEDTA和2.5g/L胰蛋白酶（宝信公司）消化，1∶2传代培养.
1.2.2传代后大鼠MSCs向成骨细胞的分化胰酶消化生长良好的第3代（P3）细胞，以1×107个/L密度种于6cm培养皿中，平皿中预先加入0.5cm×1.0cm无菌盖玻片.待细胞长到约80%融合后，加入含200mL/L胎牛血清的DMEM诱导24h，弃去.加入诱导液，其中含0.1μmol/L 地塞米松、50μmmol/L维生素C,10μmmol/Lβ甘油磷酸钠、IGF1（Chemikon）,胰岛素和100mL/L 胎牛血清.同时，设立正常对照组，只加入含100mL/L胎牛血清的培养基，其余均不加.分别诱导7，14和21d.取出盖玻片，PBS冲洗，40g/L多聚甲醛固定15min.然后应用抗Ⅰ型胶原mAb（Sigma）和ABC法（ABC试剂盒购于北京中杉公司）进行Ⅰ型胶原免疫组织化学染色.加入诱导液组，以PBS和正常鼠血清分别替代一抗作为阴性对照；应用组织化学钙钴法显示碱性磷酸酶（AKP），以不加底物β甘油磷酸钠的孵育液作为阴性对照.
1.2.3Brdu标记MSCs消化P3细胞，以0.5×108个/L将MSCs接种于12孔培养皿，在将要加入Brdu的培养皿中预先放入无菌盖玻片.当细胞铺满皿底40%时加入Brdu（Sigma）溶液，使其终浓度分别为5，10和15μmol/L.孵育12，24，48，72和96h后取出盖玻片，用PBS 冲洗，40g/L多聚甲醛固定15min，应用抗BrdumAb（Sigma）和ABC法进行免疫组织化学染色显示Brdu，除在正常血清封闭前以2mol/L盐酸变性30min外，其余均按试剂盒说明书进行操作.以PBS和正常鼠血清分别替代一抗作为阴性对照.另外，将用10μmol/LBrdu标记的MSCs进行传代培养，观察细胞传代后的标记效果.。