气相色谱法测定己酸菌发酵液中的己酸等有机酸含量

DOI ：10.13746/j.njkj.2017166

基金项目：四川省科技计划项目《丢糟资源化利用技术开发与集成示范(重点)》（2017JY0110）。

收稿日期：2017-06-11

作者简介：袁华伟(1967-)，男，四川安岳人，高级工程师，博士，主要研究方向为白酒微生物发酵，发表论文数篇。通讯作者：胡永奇（1970-），男，四川阆中人，工程师，经济师，硕士，主要研究方向为白酒酿造，发表论文数篇。优先数字出版时间：2018-01-11；地址：/kcms/detail/52.1051.TS.20180111.1319.009.html 。

气相色谱法测定己酸菌发酵液中的己酸等有机酸含量

袁华伟1，2，3

，杨泽刚1，兰著玺1，游

玲1，刘光钱2，胡永奇2，3，王松涛2，3，沈才洪2，

3

（1.宜宾学院生命科学与食品工程学院，四川宜宾644000； 2.泸州老窖股份有限公司，四川泸州646000；

3.国家固态酿造工程技术研究中心，四川泸州646000）

摘

要：对气相色谱法测定己酸菌发酵液中己酸等有机酸含量的预处理方法进行了研究，优化了色谱

条件，建立了一种快速测定己酸菌发酵液中己酸、丁酸、乙酸等有机酸的方法。己酸菌发酵液经2M 硫酸酸化至pH2后经高速冷冻离心，再经微孔滤膜过滤，利用Pure -WAX 毛细管色谱柱、以2-乙基丁酸为内标、直接进样气相色谱法定量测定。色谱分析条件为：检测器温度260℃，汽化温度250℃，柱温150℃，分流比50∶1，采样时间10min 。研究结果表明，应用该法测定己酸菌发酵液中的己酸、丁酸、乙酸等有机酸含量，RSD 为2.22%～2.54%，加标回收率在96.83%～103.71%之间。该方法具有快速方便、定量准确等特点，适合己酸菌发酵液中己酸、丁酸、乙酸等有机酸的检测。关键词：己酸菌发酵液；己酸；气相色谱法；检测中图分类号：TS262.3；TS261.7；TS261.4文献标识码：A

文章编号：1001-9286（2018）03-0102-04

Determination of Caproic Acid and Other Organic Acids in

Fermented Liquid of Caproic Acid Bacteria by GC

YUAN Huawei 1,2,3,YANG Zegang 1,LAN Zhuxi 1,YOU Ling 1,LIU Guangqian 2,

HU Yongqi 2,3,WANG Songtao 2,3and SHEN Caihong 2,3

(1.College of Life Science and Food Engineering,Yibin University,Yibin,Sichuan 644000;2.Luzhou Laojiao Co.Ltd.,Luzhou,Sichuan 646000;3.National Engineering Technology Research Center of Solid-state Brewing,Luzhou,Sichuan 646000,China)Abstract :The pretreatment for measuring the content of caproic acid and other organic acids in fermented liquid of caproic acid bac-teria was studied.Firstly,the fermented liquid underwent 2M sulfuric acid acidification till pH=2,then through high-speed freeze cen-trifugation and micropore filtration,direct sampling GC using Pure-WAX capillary-column and 2-ethyl butyric acid as internal stan-dard was performed.The chromatographic conditions were as follows:the detector temperature was at 260℃,the vaporization tem-perature was at 250℃,the column temperature was at 150℃,the split ratio was 50∶1and the sampling time was 10min.The results showed that the content of caproic acid,butyric acid,acetic acid and other organic acids could be measured by such method,RSD was 2.22%to 2.54%,and standard addition recovery was 96.83%to 103.71%.This method had the advantages such as convenient,fast and accurate determination.

Key words :caproic acid bacteria fermented liquid;caproic acid;gas chromatography;determination

白酒中的有机酸可以调节口味使酒体醇和爽口，更主要的是酸类物质是形成相对应的乙酯类香

味成分的前体物质。不同的有机酸与醇在微生物酶的催化作用下，生成不同的酯，没有有机酸就没

有相对应的酯类物质生成。其中己酸乙酯在浓香型白酒中的含量最高，对浓香型白酒的贡献也最大，是浓香型白酒的主体香味物质，也是判定浓香型白酒质量等级的关键指标[1]。同时，己酸乙酯也是酱香型白酒三大典型原酒之一的窖底香型中最突出的香味物质，赋予其芳香浓郁的显著特征[2]。在白酒特定的酿造环境下，己酸乙酯主要是在窖池内通过微生物的酯化作用合成。由己酸菌产生的己酸和酵母菌产生的乙醇生物合成[3-4]。由于己酸菌的生长速度缓慢，生长繁殖需要严格的厌氧条件，所以研究浓香型白酒中的产酸细菌重点在己酸菌[5-6]。己酸菌培养液中己酸等有机酸的组成及其含量往往随菌种的种类、纯度和发酵工艺的不同而不同，分析其中的有机酸组成与含量对开发己酸菌菌种资源、完善己酸菌发酵生产工艺条件和科学指导白酒生产都具有重要意义。因此，己酸菌在筛选、培养过程中如何快速、准确测定发酵液中的己酸等有机酸的含量是非常值得研究的。

目前测定己酸菌发酵液中己酸的方法主要有：以醋酸铜与己酸反应生成蓝色己酸铜沉淀，被乙醚抽提出来使乙醚层呈现蓝色的显色反应为原理的比色法[7-8]；己酸菌发酵液进行蒸馏后，在毛细管色谱柱上直接进样检测[9]；经乙醚萃取后用非极性毛细管色谱柱分析的气相色谱法[10]。比色法分析发酵液中的己酸含量时，培养基中醋酸钠及其他有机酸的存在对己酸定性显色反应有影响[11-12]。采用蒸馏或乙醚萃取的方法处理己酸菌发酵液，用气相色谱法测定己酸含量，可避免比色法的误差，提高分析准确度，但前处理操作复杂，并且分析时间也较长。本研究对气相色谱法测定己酸菌发酵液中己酸的方法作了改进，建立了一种利用毛细管色谱柱、直接进样气相色谱法定量测定己酸菌发酵液中的己酸、丁酸、乙酸等有机酸的方法。

1材料与方法

1.1材料、试剂及仪器

菌株：使用泸州老窖股份有限公司自行分离筛选自老窖泥的产己酸细菌进行己酸发酵。

己酸菌培养基（巴氏合成培养基）：(NH4)2SO40.05%、K2HPO40.04%、MgSO4·7H2O0.02%、乙酸钠0.5%、酵母膏0.1%、CaCO31%、乙醇2%。

试剂：己酸、丁酸、乙酸、2-乙基丁酸（均为标准品），天津市光复精细化工研究所；无水乙醇（色谱纯），天津市科密欧化学试剂开发中心。准确称取己酸、丁酸、乙酸、2-乙基丁酸100mg于100mL容量瓶中，用25%色谱纯乙醇溶液定容至刻度。配制标准溶液的浓度为己酸1000mg/L、丁酸1000mg/L、乙酸1000mg/L、2-乙基丁酸1000mg/L。

仪器设备：色谱仪为日本岛津公司GC-2010型气相色谱仪，FID氢火焰检测器，配N2000工作站。色谱柱为日本岛津公司的Inert Cap TM Pure Wax 毛细管柱，长30m，内径0.25mm，膜厚0.25μm。

1.2样品处理

取样品40mL加2M硫酸酸化至pH2，加无水乙醇至50mL，在12000r/min、4℃条件下进行冷冻离心5min，取上清液，过0.2μm微孔滤膜。进样前将样品和内标1∶1混匀。

1.3气相色谱分析条件

采用Inert Cap TM Pure Wax毛细管柱，载气为高纯氮气，燃烧气为H2。内标为以25%乙醇配制的1000mg/L的2-乙基丁酸。检测器温度260℃，汽化温度250℃，柱温150℃。进样量为0.5μL，分流比50∶1，采样时间10min。N2000色谱工作站，采用保留时间定性，内标法定量。

2结果与讨论

2.1发酵液预处理方法

直接进样毛细管柱气相色谱法分析己酸菌发酵液中的己酸等有机酸，进样的样品需达到色谱进样要求。要求进样的样品无固形物，关键要对样品进行处理。发酵培养基中添加了碳酸钙，发酵液中己酸等有机酸很大一部分以盐的形式存在，因此酸化处理己酸发酵液是必要的。己酸等有机酸沸点都比较高，不容易蒸馏出，蒸馏后的残液中己酸含量占很大部分[13]。如用盐酸酸化，盐酸与发酵液中的碳酸钙反应生成溶于水的氯化钙，样品中存在一定的盐分，对色谱柱的使用寿命有不良影响。用硫酸酸化后生成难溶于水的硫酸钙，可离心分离去

发酵液中的己酸等有机酸含量103