化学发光免疫分析法报告

化学发光免疫分析法概述

化学发光是物质在氧化还原过程中发光的现象。能产生化学发光的物质称为化学发光剂。

化学发光免疫分析法是用化学发光剂包括发光物质或者发光反应催化剂等直接标记抗体或抗原的一类免疫测定方法。将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应结合起来，藉以检测抗原或抗体的分析技术。将发光物质或酶标记在抗原或抗体上，免疫反应后，通过化学发光反应来测定发光标记物或酶标记物的化学发光信号，从而确定待测抗原或抗体的浓度.化学发光免疫分析（chemiluminescence immunoassay，clia）兴起于20世纪80年代，由于方法成熟，目前已经成为临床免疫诊断的主要方法。化学免疫分析是将化学发光或生物发光体系与免疫反应相结合，用于检测微量抗原或抗体的一种新型标记免疫测定技术。临床上所用的化学发光试剂盒包含两个部分，即免疫反应系统和化学发光系统。免疫反应系统，其基本原理同酶联免疫技术（elisa）。

根据标记物的不同可分为三大类:1.标记酶的化学发光免疫分析，其中应用

最多的是三种酶：依据HRP-Luminol-H

20

2

-对碘苯酚(PIP)增强型化学发光反应体

系进行检测的辣根过氧化物酶(HRP)；能催化AMPPD的分解反应从而产生化学发光进行抗原抗体定量分析的碱性磷酸酶(ALP)；另一种是虫荧光素酶，能催化氧化虫荧光素产生发光而实现对ATP、各种激素、药物以及抗原抗体的定量分析。2.标记直接化学发光物质的化学发光免疫分析，最典型的是标记氨基异鲁米诺(ABEI)和吖啶酯类的化学发光免疫分析。3.标记荧光物质，通过过氧化草酸酯化学发光体系进行检测的化学发光免疫分析。按照标记反应的过程和形成结合物的结构特点，可以将标记分子分为“直接偶联”和“间接偶联”两种方式。间接偶联可以在原有结构中引进新的活性基，增加反应活性。

下面就鲁米诺、光泽精等几种化学底物发光原理作一简要评述。

1 常见的发光物质

1.1 鲁米诺和其衍生物鲁米诺（luminol）和其衍生物是最早在化学发光免疫分析中使用而且被临床较广泛应用的一种常用的化学发光物。吴秋华等［1］对2003年以前鲁米诺在化学发光反应的进展以及应用做过详细的概述。

在碱性溶液中，鲁米诺可以被多种氧化剂氧化（H

2O

2

）而发光，发光底物在

酶（辣根过氧化物酶、过氧化氢酶和黄嘌呤氧化酶等）的作用下，发生化学反应并释放出大量的能量，产生激发态的中间体，当激发态中间体回到稳定的基态时，可同时发射出光子。

鲁米诺发生化学发光反应时可以辐射出最大发射波长为425nm的光量子。利用发光信号测量仪器即可测量光量子产额，该光量子产额与样品中的待测物质的量成正比。由此可以建立标准曲线并计算样品中待测物质的含量。鲁米诺发光机理如图1。

图1 鲁米诺发光示意图（略）

1.2 光泽精光泽精为吖啶翁盐衍生物，以硝酸盐的形式存在，学名n，n－二甲基二吖啶硝酸盐，是一个传统的荧光试剂。光泽精是一种绿色的荧光物质，其化

学式为C

28H

22

N

4

O

6

，在碱性条件下，过氧化氢将其氧化成四元环过氧化物中间体，

而后裂解生成激发态的吡啶酮而发出470 nm的光，具有较高的发光效率。光泽精可用于检测甲胎球蛋白（afp）［4］。

与鲁米诺相比，光泽精有以下优点［3］：光泽精的发光体N-甲基吖啶酮比鲁米诺的发光体3-氨基邻苯二甲酸发光更强、发光效率更高。光泽精的化学发光对某些还原剂非常敏感，如抗坏血酸、肌酸酐、尿酸、葡糖醛酚，检出限一般为1 μmol～10 μmol。含α-羟羰基的化合物与光泽精会发生强烈的化学反应，如甘油、羟基乙醛、二羟基丙酮酯等。光泽精发光机理如图2。

图2 光泽精发光示意图（略）

1.3 吖啶酯类吖啶酯（acridiniumester，ae）类发光效率与试剂中的可解离酸性基团的pka有密切关系，pka一般应<11。在化学发光免疫分析过程中，

经过洗涤的磁性颗粒中，加入氧化剂（H

2O

2

）和PH纠正液（NaOH），使其呈碱性，

这时吖啶酯在不需要催化剂的情况下分解并发光，由集光器进行接收，经光电倍增管放大作用，记录1秒钟内所产生的光子能，这部分光的积分与被测物的含量成正比，根据标准曲线，仪器可以自动计算出被测定物质的含量。

化学发光仪

美国雅培AXSYM化学发光分析仪

美国康仁ACS-180全自动化学发光免疫分析仪

VITROS ECI化学发光仪

MP280化学发光免疫分析仪

德国lumino发光免疫分析仪

化学发光免疫分析法在肿瘤标志物检测上的应用

肿瘤标志物是肿瘤细胞在癌变过程中由于癌基因的表达而生成的抗原和其他生物活性物质，在正常组织或良性疾病中不产生或产生极微。肿瘤标志物的检测，对于肿瘤的早期发现、病情的发展、治疗后的评价、监测复发和转移等方面都具有一定的应用价值。

2.1 甲胎球蛋白（afp）的检测 afp是诊断肝癌的可靠指标之一，从而使肝癌的诊断获得重大突破。大量研究结果表明，原发性肝癌者血清afp含量90%以上超过500 ng/ml,最高可达每毫升数毫克，一般正常人血清afp含量都在20 ng/ml以下。临床检验项目中，化学发光与酶免疫技术相结合的化学发光酶免疫技术测定血液afp是发现原发性肝癌最简捷、快速、灵敏的方法［5］。afp检测对发现临床上许多无症状、无体征的“小肝癌”，对早期治疗、提高患者的生存率起到了十分重要的作用。此外，对人群体内afp进行筛查，还可以对急慢性肝炎和肝硬化、先天性胎儿畸形和恶性畸胎瘤作出诊断。

2.2 前列腺特异性抗原（psa）的检测 psa是由人前列腺上皮细胞合成并分泌至精浆中的一种糖蛋白，分子量为33 000～34 000道尔顿。psa主要存在于前列腺组织中，女性体内不存在，当发生前列腺癌时，psa会大量释放进入血液。当血清psa＞10 ng/ml时，应高度怀疑前列腺癌；而psa 4 ng/ml～10 ng/ml 时，则为疑似病例。临床试验表明，前列腺癌患者发病后的不同时期进行血清psa含量测定，对病情的监测和预后有一定意义［6］。

2.3 癌抗原ca125的检测［7］卵巢癌是仅次于宫颈癌、宫体癌的第三位妇科肿瘤，居女性恶性肿瘤的第六位，但其死亡率却明显高于宫颈癌和宫体癌，是恶性程度最高的妇科癌症。ca125是一种卵巢癌相关抗原。为一种糖蛋白，mw>200 000。ca125在早期筛查、诊断、治疗及预后的应用研究均有报道。ca125是一种较广谱的肿瘤标志物，在易于播散转移的肿瘤中表达较高，而与组织分型相关性并不密切。测定血清ca125对卵巢癌、肝癌、肺癌诊断价值较大。因此，术前检测血清ca125有助于初步了解肿瘤的浸润情况，为进一步治疗提供参考依据。

2.4 人绒毛膜促性腺激素（hcg）检测及癌症诊断 hcg是一种糖蛋白激素，由100个氨基酸和一些单糖组成，分子量约为30 000，有α和β两个亚单位，主要具有刺激黄体发育的功能，从而维持妊娠的继续。hcg的检测除了可诊断正常妊娠外，而且还可为许多其它肿瘤的重要标志。如胃癌、胰腺癌、肝癌、多发性骨髓癌、卵巢癌、乳癌等。

由于化学发光免疫分析方法的检测灵敏度要远远高于elisa、荧光免疫等，