分子生物学课程论文

DNA测序技术的发展历史
摘要：测序技术是现代分子生物学研究中最常用的技术。

从1977年第一代测序技术的出现。

经过30多年的发展，DNA测序技术取得重大进展，以高通量为特点的第二代测序技术逐步成熟并商业化，以单分子测序为特点的第三代测序技术也已经出现。

介绍每一代测序技术的特点，展望新的测序技术时于未来生物学研究及人们自身健康与人类疾病等方面研究的影响。

关键词：第一代DNA测序技术第二代DNA测序技术第三代DNA测序技术高通量
The History of DNA Sequencing Technology
Abstract：As the commonly used technology in molecular biology, DNA sequencing technology has seen great advances in more than thirty years since 1977．Next-generation DNA sequencing technology，characterized by high-throughput，has entered the market. The
third-generation sequencing technology has also arisen，which can sequence single DNA molecular. In this review，we introduced three generations of sequencing technologies and its applications．At the end of the review，the effect of new DNA sequencing technologies on research and medicine were previewed．
Key words: First generation DNA sequencing technology Second generation DNA sequencing technology Third·generation DNA sequencing technology High-throughput
自从1953年，沃森和克里克提出DNA分子的双螺旋结构模型作为现代分子生物学诞生的里程碑。

此后，人们一直致力于DNA结构和序列的研究，使得DNA测序技术应运而生。

该技术对探索生命奥秘、治疗疾病，以及整个生物科学乃至医学的发展起到了巨大的推动作用，并具有广阔的应用前景。

成熟的DNA测序技术始于20世纪70年代中期。

1977年Maxam和Gilbert报道了通过化学降解测定DNA序列的方法[1]。

同一时期，Sanger发明了双脱氧链终止法[2]。

20世纪90年代初出现的荧光自动测序技术将DNA测序带入自动化测序的时代。

这些技术统称为第一代DNA测序技术。

最近几年发展起来的第二代DNA测序技术则使得DNA测序进入了高通量、低成本的时代。

目前，基于单分子读取技术的第三代测序技术已经出现，该技术测定DNA序列更快，并有望进一步降
低测序成本，改变个人医疗的前景。

1.DNA测序技术的出现
20世纪70年代中期，2种不同的DNA测序方法几乎同时发表：Sanger等提出“DNA双脱氧链末端终止测序”，又称Sanger测序；Maxam等提出“DNA 化学降解测序”。

前者是利用DNA聚合酶I的聚合反应，在反应体系中引入一定比例的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)作为终止剂，由于DNA聚合酶不能区分dNTP和ddNTP，因此ddNTP可以掺人新生单链中，而ddNTP的核糖基3’碳原子上连接的是氢原子而不是羟基，因而不能与下一个核苷酸聚合延伸，合成的新链在此终止，终止点由反应中相应的双脱氧核苷酸三磷酸而定。

后者的测序原理是在选定的核苷酸碱基中引入化学基团，经过化合物处理使DNA分子在被修饰的核苷酸位置降解。

虽然这2种测序方法的原理不同，但它们都是根据核苷酸在某一固定的点起始，随机在某一特定碱基处终止，形成一系列以某一特定脱氧核糖核苷酸(A、T、C、G)为末端的长度各异的寡聚脱氧核糖核苷酸混合物，然后通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，经放射自显影后，直接从胶片上读出DNA的顺序DNA序列测定技术出现后，迅速超越了蛋白质和RNA测序技术，成为现代分子生物学中最重要的技术。

但是，这两种测序方法都依赖放射性同位素标记来实现，操作步骤繁琐，难以满足大规模测序的要求。

2.第一代DNA测序技术
2.1 荧光自动测序技术
荧光自动测序技术基于Sanger原理，用荧光标记代替同位素标记，并用成像系统自动检测，从而大大提高了DNA测序的速度和准确性。

20世纪80年代初Jorgenson和Lukacs[3,4]等提出了毛细管电泳技术(capillary electrophoresis)。

1992年美国的Mathies实验室首先提出阵列毛细管电泳(capillary array electrophoresis)新方法，并采用激光聚焦荧光扫描检测装置，25只毛细管并列电泳，每只毛细管在1.5 h内可读出350 bp，DNA序列分析效率可达6 000 bp/h[5]。

1995年Woolley[6]刊研究组用该技术进行测序研究，使用四色荧光标记法，每个毛细管长3.5 cM，在9 min内可读取150个碱基，准确率约97％。

如这一时期ABI公司开发的ABI 3730测序仪即是基于毛细管电泳和荧光标记技术的DNA
测序仪。

2．2 杂交测序技术
杂交法测序是20世纪80年代末出现的一种测序方法，利用DNA杂交原理，将一系列已知序列的单链寡核苷酸片段同定在基片上，把待测的DNA样品片段变性后与其杂交，根据杂交情况排列出样品的序列信息[7]。

杂交测序检测速度快，采用标准化的高密度寡核苷酸芯片能够大幅度降低检测的成本，具有部分第二代测序技术的特点。

但该方法误差较大，且不能重复测定。

3 第二代DNA测序技术
随着人类基因组计划的完成，人们进入了后基因组时代，即功能基因组时代，传统的测序方法已经不能满足深度测序和重复测序等大规模基因组测序的需求，这促使了新一代DNA测序技术的诞生。

第2代测序技术的核心思想是边
合成边测序。

所以被誉为“下一代测序技术”：即依照第l代Sanger测序技术的原型，利用测序仪器捕捉新掺入的末端荧光标记来确定DNA序列组成。

现有的技术平台主要包括：454测序平台(Roche公司)[8]、Solexa测序平台(Illumina公司)[9]和SOLiD测序平台(ABI公司)[10]。

454测序法的原理是单链DNA文库被固定在特别设计的DNA捕获磁珠上。

每一个磁珠携带了一个独特的单链DNA片段引物，随后扩增试剂将磁珠乳化形成油包水的混合物，这样就形成了只包含一个磁珠和一个独特片段的微反应器。

每个独特的片段在自己的微反应器里进行独立的扩增，而没有其他竞争性或污染性序列的影响。

整个DNA片段文库的扩增平行进行。

对于每一个片段而言，扩增后产生了几百万个相同的拷贝。

随后，磁珠乳化混合物被打破，扩增的片段仍然结合在磁珠上。

携带DNA的捕获磁珠被放入PTP板中进行测序。

PTP 孔的直径(29μm) 只能容纳一个磁珠(20μm)。

放置在4个单独的试剂瓶里的4种碱基，依照T、A、C、G的顺序依次循环进入PTP板，每次只进入一个碱基。

如果发生碱基配对，就会释放一个焦磷酸。

这个焦磷酸在ATP 硫酸化酶和荧光素酶的作用下，经过一个合成反应和一个化学发光反应，最终将荧光素氧化成氧化荧光素，同时释放出光信号。

有一个碱基和测序模板进行配对，就会捕获到一分子的光信号；由此一一对应，就可以准确、快速地确定待测模板的碱基序列。

所以这种测序方法也称为焦磷酸测序。

与其他新一代测序平台相比，454 测序法的突出优势是读长。

目前运用454 测序原理的GSFLX测序系统的
序列读长已超过400bp。

与454的情况相同，Solid系统也采用了微乳滴PCR与微球相结合的策略来扩增DNA模板，不过Solid系统的微球要小得多，只有1μm。

它独特之处在于其边合成边测序采用的是连接反应而不是聚合反应，同时，它运用双碱基编码策略来协助检测错误。

Solexa测序系统则是利用其专利核心技术“DNA簇”和“可逆性末端终结”，实现自动化样本制备及基因组数百万个碱基大规模的平行测序，其单链文库片段的扩增是通过所谓“桥式扩增”过程实现的。

4．第三代测序技术——直接测序技术
第三代测序技术，也被称为“下、下一代测序(next-next—generation sequencing)，因其采用单分子读取技术，有着更快的数据读取速度和巨大的应用潜能。

它不再需要PCR扩增步骤，进一步降低了测序的成本。

但在单分子水平上检测光学信号，必须降低非检测特异性背景(如游离的荧光标记dNTP)干扰。

脱氧核苷酸用荧光标记，显微镜可以实时记录荧光的强度变化。

当荧光标记的脱氧核苷酸被掺入DNA链的时候，它的荧光就同时能在DNA链上探测到。

当它与DNA链形成化学键的时候，它的荧光基团就被DNA聚合酶切除，荧光消失。

这种荧光标记的脱氧核苷酸不会影响DNA聚合酶的活性，并且在荧光被切除之后，合成的DNA链和天然的DNA链完全一样。

目前的第三代测序平台有：单分子DNA测序[11]、HeliScope单分子测序[12]、基于荧光共振能量转移的即时DNA测序[13]、纳米孔单分子测序[14]、离子流半导体测序。

第三代测序技术具有第二代测序所不具备的两个[14]优势。

第一个是直接测RNA的序列。

既然DNA聚合酶能够实时观测，那么以RNA为模板复制DNA 的逆转录酶也同样可以。

RNA的直接测序，将大大降低体外逆转录产生的系统误差。

第二个是直接测甲基化的DNA序列。

实际上DNA聚合酶复制A、T、C、G的速度是不一样的。

正常的C或者甲基化的C为模板，DNA聚合酶停顿的时间不同。

根据这个不同的时间，可以判断模板的C是否甲基化。

DNA测序技术经过30多年的发展，已经使生命研究的基本元素从单一、局部的基因或基因片段转变成整个基因组，同时这种转变又需要更加强大的测序技术来支持。

虽在未来的几年里可能会出现三代测序技术共存的局面，但低成本、高通量的第三代测序技术，将有力地推动基因组学及其分支乃至其他密切
相关学科如比较基因组学、生物信息学、系统生物学以及合成生物学的创立与发展[13]。

参考文献:
[1] Maxam A M，Gilbert W．A new method for sequencing DNA [J]. Proc Natl Acad Sci usA，1977, 74(2) :560-564．
[2] Sanger F, Nicklen S, Coulson A R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors[J]．Proc Natl Acad Sci USA, 1977,74(12):5463-5467.
[3] Jorgenson JW, Lukacs KD. Free-zone electrophoresis in glass capillaries. Clin Chem, 1981,
27(9) :155l-1553．
[4] Jorgenson JW, Lukacs KD. Capillary zone electrophoresis. Science，1983，222(4621)：266-272．
[5] Smith LM, Fung S, Hunkapiller MW, et al. The synthesis of oligonucleotides containing an aliphatic amino group at the 5’terminus: synthesis of fluorescent DNA primers for use in DNA sequence analysis. Nucleic Acids Res, 1985, 13(7):2399-2412．
[6] Woolley AT, Mathies RA. Ultra-high-speed DNA sequencing using capillary electrophoresis chips. Anal Chem, 1995, 67(20):3676-3680.
[7] Drmanac R, Labat I,Brukner I, et al. Sequencing of megabase plus DNA by hybridization:theory of the method. Genomics, 1989,4(2):114-128．
[8] Margulies M.et al. Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors. Nature, 2005, 437(7057):376-380．
[9] Fedurco M. et al. BTA. a novel reagent for DNA attachment on glass and efficient generationof solid-phase amplified DNA colonies. Nucleic Acids Res, 2006,34(3):22．
[10] Shendure J. et al. Accurate multiplex polony sequencing of an evolved bacterial genome. Science, 2005, 309(5741):1728-1732.
[11]Eid J, Fehr A, Gray J, et al. Real-time DNA sequencing from single polymerase molecules. Science, 2009,323(5910):133-138.
[12]Harris TD, Buzby PR, Babcock H, el al. Single-molecule DNA sequencing of a viral genome. Science, 2008, 320(5872):106-109．
[13] Schadt EE, Turner S, Kasarskis A. A window into third generation sequencing. Hum Mol Genet, 2010, 19(R2): R227-R240.
[14] Stoddart D, Heron AJ, Mikhailova E, et al. Single-nueleotide discrimination in immobilized DNA oligonucleotides with a biological nanopom. Proc Nat Acad sci USA, 2009, 106(19):
7702-7707.
[15]周晓光,任鲁风,李运涛,等.下一代测序技术:技术回顾与展望.中国科学生命科学，2010,40(1):23-37．。