流式细胞仪简介和使用方法

从组织获取淋巴细胞
淋巴节、扁桃体、脾、胸腺等淋巴组织由于结构松
散，容易分离成单个细胞。一般对样本进行切剪、研磨、过滤 便可。
方 法：
1. 将样本置于陪替氏培养皿，加入15ml BSA-PBS； 2. 将样本切成3-4mm3大小，用镊子将其分离；
3. 将样本经滤网过滤，用密度法分离、提纯淋巴细胞。
其他标本：通常在其他组织中分离淋巴细胞需用酶进
其他类型细胞
在组织中提取细胞通常使用酶消化法。同样对于不 同组织处理方法也各异，以下是讲述通用的胶原酶消 化法制备组织细胞。改良后的此法尚可用于制备人、 鼠上皮细胞。
材料
1. 解剖刀 2. 0.15%胰蛋白酶 3. Hanks’s缓冲盐或PBS，pH7.3 4. 不含Ca、Mg离子的HBSS 5. II型胶原酶 6. 1%BSA或5%FBS 7. 5ml的吸样管 8. 35um尼龙滤网 9. DNase
反应体积
• 样本中加完抗体后， 1×106细胞反应体积应不小于100ul。
抗体染色
• 最为普通的抗体染色原则：
1×106细胞对1 ug 抗体（抗体供应商所推荐 使用单位），此浓度90%处于过饱合状态
操作
1. 将样本置于皮氏培养皿，加15ml BSA-PBS，将样本切 成1mm3大小，用镊子将其分离； 2. HBSS或PBS洗清 3. 加入10ml无Ca、Mg离子0.2% II型胶原酶溶液0.02% DNase 1的HBSS； 4. 37ºC摇床上孵育15~60分钟，视样本类型而定；
5. 用5ml的吸样管反复吹打，制成单个细胞悬液； 6. 使用35um滤网过滤，300g离心5分钟； 7. 用PBS或细胞培养液重悬样本；对于某些
目标细胞数量及检测终浓度：1×106/ml
• 外周血白细胞分析：100ul全血 • 血小板分析：1~5ul全血（根据样本血小板数量） • 红细胞分析：1ul全血（根据样本中红细胞数稀释后使
用） • 骨髓：100ul • 其他样本，计数后决定使用体积
细胞计数方法
• 传统手工计数：耗时、准确度差 • 流式细胞仪计数： BD，Coulter仪器：高速4ul/秒，中速2ul/秒，低速0.5ul/秒？ partec仪器:最为精密的细胞计数器，直接报告细胞浓度
注：化学试剂直接作用于红细胞的溶血剂有：以草酸
为主的溶血剂（Coulter Q-Prep），基于NH4CL的BD 公司的FACSLyse溶血剂。
优点：溶血时间快？？？，在流式细胞仪上可清楚地
将淋巴、单核、粒及红细胞碎片相区分。
缺点：需严格掌握溶血时间，对白细胞表面抗原有影响，
随时间细胞形态变化大。
第一部分
流式细胞仪标本准备 染色的一般原则及方法
标本来源：
外周血、骨髓、组织块、培养细胞、脱落细胞及其他。 根据各种具体实验，选用不同的抗凝剂。
可用的抗凝剂如下：
EDTA： 2mg/ml 枸椽酸钠：0.38% 肝素：15IU/ml
标本处理时间：
新鲜样本分析时，样本采集后应立即分析
样本固定方法： 1%的多聚甲醛或75%的酒精，作用30分钟。 注：不同的实验，所用的固定方法不完全相同。
三、氯化铵溶血剂
1. 在一升蒸馏水中溶解8.29g NH4CL,1g KHCO3和37mg Na2EDTA 2. 调节PH值至7.2 3. 在使用前配置该溶血剂，并用0.45um滤膜过滤
富集白细胞
方法一：溶血法
1. 取100 ul抗凝全血； 2. 快速加入 2ml NH4CL溶血剂,混匀； 3. 室温孵育10分钟； 4. 4ºC，400g离心10分钟。去上清，加入2ml BSA-PBS； 5. 4ºC，400g离心10分钟。去上清，加入2ml BSA-PBS； 6. 4ºC，400g离心10分钟。去上清，调整细胞浓度至5x106/ml。
样本处理标准试剂：
一、10%Bovine Serum Albumin BSA
1. 溶解10g BSA至100ml蒸馏水中 2. 4ºC，20000 g离心30分钟 3. 分装后-20ºC保存
二、0.1% BSA-PBS缓冲液
1. 准备500ml，PH7.3 PBS 2. 加入5ml 10% BSA 3. 使用0.45um滤网过滤
仍有小块组织，重复第5步获取细胞，重复第7步； 8. 用含0.15%胰酶、0.02%DNase 1不含Ca、Mg的HBSS
重悬， 37ºC孵育一段时间加入1%BSA或5%FBS，灭 活酶活性。
细胞培养
许多原代细胞和培养细胞系，都为贴壁型生长。通常先用胰酶处理获得单细 胞悬液，需注意消化过度会损害细胞，特别是改变其表面抗原标记。 准备单细胞悬液 1.仪器和试剂： 0.25%r EDTA,pH 7.2 0.25% 的胰酶 10%血清的培养液 2.方法： a. PBS洗涤细胞； b. 加入0.25%有胰酶，37ºC处理2~8分钟； c. 倒置显微镜下观察，至大部分细胞脱落悬浮后，加入含10%血清的培养液。 d. PBS液洗涤细胞，最后配成终浓度为1×106/ml 的细胞悬液。
方法二：密度离心法提取单个核细胞
Histopaque 1077为Ficoll与Sodium diatrizoate(泛影酸钠) 混合物，其密度为1.119～1.077。通过离心可将全血中的粒 细胞与单个核细胞分离。粒细胞沉积于1.119～1.077的血浆 层，而单个核细胞则在1.077以下的血浆层中。
操作
1. 准备2ml抗凝血（根据实验要求确定用血量）， 等量PBS稀释；
2. 准备1ml Histopaque 1077 (Sigma)； 3. 室温下700g离心30分钟； 4. 仔细将含有单个核细胞血浆层吸出；
5. 加4ml BSA-PBS，400g离心10分钟； 6. 加2ml BSA-PBS清洗2次。
行消化。对于不同标本，处理方法也各不相同。
制备大鼠肾脏浸润细胞
材料： 解剖刀、CO2孵育箱、滤网
以及含1mg/ml胶原酶的细胞培养液（无血清）
方 法：
1. 将样本置于皮氏培养皿，用解培刀切成小块； 2. 加入10ml胶原酶溶液，37ºC CO2培养箱孵育30分钟； 3. 滤网过滤； 4. 密度梯度法离心提纯淋巴细胞。