分析方法研究与验证思路

分析方法验证
• 线性 • 适用与有定量要求的杂质检查。在定量限至一定
的浓度范围内配制6份浓度不同的供试液，分别测 定该杂质峰的面积，计算相应的含量。以含量为 横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行线性 回归分析。可接受的标准为：回归线的相关系数 （R）不得小于0.990，Y轴截距应在100％响应值 的25％以内。
系统适用性 专属性☆ LOQ# N/A
系统适用性
专属性☆
LOD 专属性☆
LOD N/A 专属性☆ LOD 专属性☆ LOD
系统适用性#
精密度 精密度 N/A
N/A N/A N/A
专属性☆ N/A 专属性☆
电泳
N/A
精密度 LOQ和LOD
N/A
专属性☆
分析方法确认内容
分析技术 含量测定 系统适用性 溶液稳定性 精密度 专属性☆ 线性和范围 系统适用性# 精密度 精密度 线性和范围 N/A 杂质测定 定量 系统适用性 溶液稳定性 精密度 专属性☆ LOQ 系统适用性# 精密度 LOQ 精密度 专属性☆ 精密度 LOQ和LOD# 专属性☆ 精密度 LOQ和LOD 限度 系统适用性 专属性☆ LOD 专属性☆ LOD N/A 专属性☆ LOD 专属性☆ LOD 性能测定 鉴别测定
，平行测定两次杂质的含量，然后将上述溶液分 别贮存在室温与冰箱冷藏室（4℃）中，在1、2、 3、5和7天时分别平行测定两次主成分与杂质的含 量。 可接受的标准为：杂质含量的绝对值在±0.1％以 内，并不得出现新的大于报告限度的杂质。根据 统计数据确定供试品溶液的保存条件及效期。
•
分析方法验证内容
分析技术 含量测定 杂质测定 定量 系统适用性 系统适用性 HPLC 溶液稳定性 精密度 专属性☆ 限度 性能测定 鉴别测定
分析方法验证
• 准确度 • 对于有定量要求的杂质要通过回收率试验验证方
法的准确度。例如某杂质的限度为0.2%，可分别 配制该杂质浓度为0.1％、0.2％和0.3％的杂质溶 液各三份，分别测定其含量，将实测值与理论值 比较，计算回收率。各浓度下的平均回收率均应 在80%-120%之间，如杂质的浓度为定量限，则 该浓度下的平均回收率可放宽至70%-130%。
流动相的选择和优化
• 流动相的要求 • 被测物之间分离良好，分离度达到1.5以上
。主成分保留时间以10分钟左右为宜。分 析时间通常为主成分保留时间的2~3倍。分 析时间过长的可考虑采用剃度洗脱。
薄层色谱法测定有关物质
• 正向色谱系统 • 对照品溶液斑点建立梯度对照，如设定杂
质斑点1.0%的自身稀释主斑点，需增加 0.5%，0.2%，0.1%三个斑点。如0.1%的 斑点不显示出，则增大点样量
溶液稳定性
精密度 专属性☆ LOQ (S/N≈10) LOD# 系统适用性 溶液稳定性 精密度 专属性☆ LOQ和LOD# 系统适用性# 精密度 LOQ和LOD# 精密度 专属性☆ 精密度 LOQ和LOD# 专属性☆
系统适用性 专属性☆ LOQ# LOD N/A 系统适用性 专属性☆
系统适用性 溶液稳定性 GC 精密度 专属性☆ 线性和范围 分光光度法 容量分析 TLC
• 中性成分 • 一般选择甲醇-水、乙腈-水两种系统。乙腈
-水系统由于粘度小，通常可以得到良好的 柱效。 • 被测物为极性较大的中性成分时，系统中 甲醇或乙腈的比例可适当小些。被测物为 极性较小的中性成分时，可适当增大甲醇 或乙腈的比例。
流动相的选择和优化
• 碱性成分 • 向流动相中加入胺类扫尾剂。常用三乙胺
10ul 10ul 10ul
100ng 10ng 0.1ng
10% 1% 0.01%
1000倍 100倍 基准点
流动相的选择和优化
• 试验样品 • 取主成分和各杂质对照品，配成主成分浓
度100%，各杂质浓度为1%的溶液进行测 定，验证色谱系统的适用性。 • 同时需要将强制破坏试验供试品分析。
流动相的选择和优化
分析方法验证
• 系统适应性 • 适用与有定量要求的杂质检查。 • 配制6份相同浓度的杂质溶液进行分析，该
杂质峰峰面积的相对标准差应不大于2.0% ，保留时间的相对标准差应不大于1.0%。 另外，杂质峰的拖尾因子不得大于2.0，理 论塔板数应符合质量标准的规定
分析方法验证
• 溶液稳定性 • 按照分析方法分别配置对照品溶液与供试品溶液
DMF,DMSO,H2O等 • 检测器：FID 可应用于大部分的溶剂检测； 部分使用ECD. • 对于具有紫外吸收的溶剂，如吡啶，甲苯 等可用HPLC方法。
气相条件的建立
• 进样器温度：大于沸点，小于分解温度 • 柱温：必须低于进样器和检测器温度30-70
；可以使用恒温或程序升温； • 检测器温度 • 流速 • 色谱柱：相似相溶原理
分析方法验证
• 耐用性 • 分别考察流动相比例变化±5％、流动相pH值变
化±0.2、柱温变化±5℃、检测波长变化±5nm 、流速相对值变化±20％以及采用三根不同批号 的色谱柱进行测定时，仪器色谱行为的变化，每 个条件下各测试两次。可接受的标准为：各杂质 峰的拖尾因子不得大于2.0，杂质峰与其他成分峰 必须达到基线分离；各条件下的杂质含量数据（ n=6）的相对标准差应不大于2.0%，杂质含量的 绝对值在±0.1％以内。
各实验参数的建立过程
波长：取主成分、合成中间体和降解产物对 照品，配成一定浓度后进行紫外扫描。通 过DAD/PDA检测器扫描各物质的紫外吸收 图，确定各物质吸收相近的波长测定 如采用主成分最大吸收波长，需进行各杂质 校正因子的测定。
各实验参数的建立过程
• 供试品溶液浓度的确定
首先确定LOD, 向上推至少10000倍，即为 供试品溶液浓度
分析方法验证
• 专属性 • 空白对照应无干扰，主成分峰或需定量的
杂质峰与其它峰应能完全分离，分离度不 得小于1.5。
分析方法验证
• 检测限与定量限 • 杂质峰与噪音峰信号的强度比应不得小于3
。 • 杂质峰与噪音峰信号的强度比应不得小于 10。另外，配制6份最低定量限浓度的溶液 ，所测6份溶液杂质峰保留时间的相对标准 差应不大于2.0%，峰面积的相对标准差应 不大于5.0%。
有关物质分析方法
3. 杂质对照品定位，主成分自身稀释 很难获得纯度较高，满足定量检测的杂质 对照品时采用。但仍能提供纯度不高，可 供定位的杂质对照品 要求杂质与主成分的相对响应因子应在0.91.1范围Fra Baidu bibliotek内
有关物质分析方法
4、加校正因子的自身对照法 很难获得纯度较高，满足定量检测的杂质对 照品时采用。但仍能提供纯度不高，可供 定位的杂质对照品 杂质与主成分的相对响应因子超出0.9-1.1 范围
残留溶剂检测方法
• 直接进样：产品的分解不干扰溶剂的检测，
不容易污染进样器 • 顶空进样：流行的做法。
残留溶剂检测方法
• 内标法：预先配制好内标溶液，采用该溶
液配制对照品溶液和供试品溶液； • 内标物：选择与待测溶剂沸点相近的烷烃 类化合物； • 外标法：流行的做法；
残留溶剂检测方法
• 对照品浓度：限度浓度 • 溶剂选择：溶解产品和待测物质，例如：
有关物质分析方法
• 药典方法 • 国家标准 • 参考文献 • 建立方法
有关物质分析方法
1 、杂质对照品进行定量测定 不受杂质紫外吸收的影响 但需要获得杂质标准品
有关物质分析方法
2、归一化法 方法简单，但是做线性时需要从定量限做 到供试品浓度的150%，相关系数不低于 0.99；且需要满足自身对照法的条件。
HPLC/GC
精密度
系统适用性 专属性☆
分光光度法
精密度 N/A N/A
专属性* N/A 专属性
容量分析 TLC
电泳
N/A
N/A
专属性☆
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、二乙胺、乙二胺等。 • 加入反离子，常用的离子对试剂为烷基磺 酸盐，如戊烷磺酸钠、庚烷磺酸钠、辛烷 磺酸钠及十二烷基磺酸钠。高碳数离子对 试剂使保留时间过长，可更换低碳数的离 子对试剂。流动相的pH一般为3~5。
流动相的选择和优化
• 酸性成分 • 向流动相中加入少量弱酸，常用甲酸、醋
酸。适用于分离3≤pKa≤7的弱酸。 • 加入反离子，常用的离子对试剂为四丁基 季胺盐及四丁基磷酸盐等。流动相的pH一 般为7~7.5。
分析方法验证
• 精密度 • 适用与有定量要求的杂质检查。 • 重复性 配制6份杂质浓度（限度浓度）相同
的供试品溶液，由一个分析人员在相同的 条件下进行测试，所得6份供试液杂质含量 的相对标准差应不大于10%。
分析方法验证
• 中间精密度 • 配制6份杂质浓度（一般为0.1%）相同的供
试品溶液，分别由两个分析人员使用不同 的仪器与试剂进行测试，所得12个含量数 据的相对标准差应不大于15%。
分析方法研究思路
• 残留溶剂分析方法研究 • 有关物质分析方法研究 • 分析方法验证
残留溶剂研究
• 总原则：合成过程中使用到的有机溶剂，
需建立分析方法，并予以测定。 • 质量标准拟定原则：除第一类溶剂外，未 检出的有机溶剂可以不拟定，仅拟定最后 一步重结晶溶剂 • 首选气相分析方法，部分可以使用液相等 手段
各实验参数的建立过程
• 最小峰面积的设定
一般设置为主峰峰面积的0.01%-0.05%
测定方法中的浓度关系
浓度 进样量 绝对量 相对于供试 倍数关系 品溶液有浓 度
100% 10000倍
有关物质供 试品溶液浓 度 含量测定浓 度 自身对照溶 液浓度 最低检出限
0.1mg/ml
10ul
1ug
10ug/ml 1.0ug/ml 10ng/ml