荧光光谱的原理及应用

发射波长：固定激发光的波长而不断改变荧光的测定波
长并记录相应的荧光强度，所得到的荧光强度对发射波长 的谱图则为荧光的发射波长。
750000
Ex 463 nm
500000
Em 530 nm
图 荧光染料C-540A 的激发和发射光谱
Intensity
250000
0 400 500 600 700
Wavelength / nm
Fluorescein
Rhodamine B Alexa Fluro 350
495
570 343
519
590 442
DPH
EGFP Calcein
362
488 496
432
507 517
我们有关荧光的工作
荧光稳态模块
系统总图
显微荧光模块
磷 光 模 块 荧光寿命模块
图 荧光分光光度计的光学系统
两亲性超支化聚合物分子自组装
常用偏振研究的荧光分子：
1,6-二苯基-1,3,5-己三烯(DPH)；罗丹明B；2-苯胺基-6-萘 磺酸钠(2,6-ANS)
荧光共振能量转移(FRET)
基本概念
定义：
当一个荧光分子（又称为供体分子，Donor）的荧光光谱 与另一个荧光分子（又称为受体分子，Acceptor） 的激发 光谱相重叠时， 供体荧光分子的激发能诱发受体分子发 出荧光， 同时供体荧光分子自身的荧光强度衰减。
供体分子的发射态偶极矩与受体分
子的吸收态偶极矩、以及它们的向 量必须满足一定的条件
应用
检测两个发光分子间的重合与共定位 检测分子间的相互作用 检测分子的折叠与构象变化
供体-受体荧光分子对
染料类(Dye)
FITC-Rhodamine Alexa488-Cy3 Cy3-Cy5
绿色荧光蛋白类(Green Fluorescent Proteins, GFPs)
Rhodamine 6G Rhodamine B
Tryptophan
95 31
13
Water Water
Water, 200C
488 514
280
L-Tyrosine
14
Water
270
荧光偏振
基本概念
定义：
测量：
①L-型或者单通道法 ②T-型多通道法
应用：
流动性,分子基本性质,酶学 分子相互作用,荧光偏振免疫,成像
荧光分析法的特点
灵敏度高。检测限比吸收光谱法低1-3个数量级；
选择性比吸收光谱法好。因为能产生紫外可见吸 收的分子不一定发射荧光或磷光；
试样用量少和方法简便
能提供比吸收光谱多的物理参数
应用范围不如吸收光谱法广，因为有的分子不发 荧光。
荧光光谱法原理
荧光和磷光的产生
吸收光谱与发射 光谱镜像关系
Wavelength / nm
芘不溶于水，溶于
乙醇、乙醚、甲苯、 四氢呋喃等有机溶 剂。随着溶剂的极 性增加，I1/I3降低， 因而可以用于聚合 物组装的研究
Journal of Polymer Science, Part A: Polymer Chemistry 48 (20) , pp. 4428-4438
①跃迁类型（pi->pi*荧光比较强，即有双键的物质荧光强） ②共轭效应（共轭体系是pi电子更容易被激发，荧光强） ③刚性平面结构（有这种结构的分子可以减小分子的振动，碰撞失活
可能性小，荧光强） ④取代基效应（给电子基团，荧光增强；吸电子基团，荧光减弱甚至 猝灭）
荧光强度与环境因素的关系
有序介质的影响(表面活性剂)
CMC
1500000
1000000
500000
0.0001 0.0005 0.001 0.005 0.01 0.05 0.1 0.5 1 mg/ml
Intensity
0 350 400 450
Wavelength (nm)
荧光量子产率
基本概念
定义：
荧光物质吸光后所发射的荧光的光子数与所吸收的激发光 的光子数之比值.(Y)
BFP-GFP BFP-YFP CFP-YFP CFP-dsRED GFP-dsRED
荧光寿命
Leabharlann Baidu
基本概念
定义：当激发光切断后荧光强度衰减至原强度的1/e所经
历的时间。它表示了荧光分子的S1激发态的平均寿命。
测试方法：
①时间相关单光子记数法(Time-Correlated Single-Photon Counting , TCSPC); ② 相调制法(Phase Modulation Methods) ③频闪技术(Strobe Techniques).
Stocks shift
发射光谱的形状 与激发波长无关
荧光的光谱特性
荧光特 性参数
稳态 波长和 强度 偏振性 能 量子产 率 荧光寿 命
瞬态
磷光 磷光光 谱
磷光寿 命
波长和强度
基本概念
激发波长：固定荧光的发射波长而不断改变激发光的波
长，并记录相应的荧光强度，所得到的荧光强度对激发波 长的谱图称为荧光的激发光谱。
• ①溶剂极性可增加 或降低荧光强度； ②与溶剂作用从而 改变荧光物质结构 来增加或降低荧光 强度。
• 温度升高，荧光强 度下降(因为内、 外转换增加、粘度 或“刚性”降低)。
溶剂
温度
•具酸或碱性基团的 有机物，在不同 pH 值时，其结构可能发 生变化，因而荧光强 度将发生改变
pH值
内滤光 和自吸
•体系内存在可以吸收荧光 的物质，或荧光物质的荧 光短波长与激发光长波长 有重叠，称为内滤光；荧 光物质浓度较大，吸收自 身的荧光发射，称为荧光 自吸。
HBPO-star-PEO
荧光光谱法研究内容
聚合物CMC的测定
荧光猝灭法测量分子的分布
能量共振转移制备荧光呼吸囊泡 荧光偏振测量分子的流动性
荧光寿命研究体系微环境
发光聚合物荧光性能的测定
聚合物CMC的测定
400
1
3
Intensity
200
0 360 380 400 420 440 460 480
应用：
荧光寿命与物质所处微环境的极性、粘度等条件有关，因 此可以通过荧光寿命直接了解所研究体系发生的变化。
荧光寿命的计算

荧光测试技术
同步荧光测定；导数荧光测定；三维荧光光谱技术
时间分辨荧光测定；相分辨荧光测定；
荧光偏振测定；荧光免疫测定； 低温荧光测定；
固体表面荧光测定；
郑永丽 上海交通大学化学化工学院 20131115
主要内容
概述
荧光光谱法原理
荧光的光谱特性
我们有关荧光的工作
概述
基本概念
能级: 现代量子物理学认为原子的可能状态是不连续的，
因此各状态对应能量也是不连续的。这些能量值就是能级
荧光：受光激发的分子从第一激发单重态的最低振动能级
回到基态所发出的辐射。
磷光：从第一激发三重态的最低振动能级回到基态所发出
的辐射。
分子荧光光谱法(Molecular fluorescence spectroscopy )：又
称为荧光光谱法或荧光分析法．是以物质所发射的荧光强 度与浓度之间的线性关系为依据进行的定量分析，以荧光 光谱的形状和荧光峰对应的波长进行的定性分析．
live cell protein localizations. J Cell Biology, 2003, 160: 629–633 Jin Zhang, et al.,. Genetically encoded reporters of protein kinase A activity reveal impact of substrate tethering. PNAS ,2001, 98: 14997–15002 Michael G. Erickson, et al., DsRed as a Potential FRET Partner with CFP and GFP. Biophysical Journal , 2003,85:599–611 Alexander Sorkin, et al., Interaction of EGF receptor and Grb2 in living cells visualized by fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy. Current Biology 2000, 10:1395–1398
基本概念
测试方法：
1)判断激发波长：①根据分子结构判断；②参照吸收光谱； ③三维扫描 2)以判断的波长为激发，做发射扫描，可以得到发射波长 3)利用得到的发射波长，进行激发扫描，即可得到激发波长
强度：
比尔-朗伯定律 If=2.303YfI0εb c
应用：定性和定量
荧光波长和强度与结构的关系
发光聚合物荧光性能的测定
参考书目
Jonathan D. Violin,et al., A genetically encoded fluorescent reporter reveals oscillatory phosphorylation by protein kinase C. J Cell Biology, 2003,161:899–909 Elizabeth A J et l., FRET Imaging. Nature Biotechnology, 2003,21:13887-1395 Rajesh B S. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of
FRET现象的特征:
选择性激发供体,却能检测到受体发射的荧光
FRET需要条件
供体分子的发射光谱和受体分子的
吸收光谱必须有显著的重迭，一般 大于 30％； 供体分子和受体分子间的距离必须 在 1-10 nm 之间.D和A间的FRET 效 率：
R0: E=50%时供体和受体分子间的 距离 对于特定的供体受体对是常数; R: 供体和受体分子间的距离. E: FRET效率. 对于R特别灵敏
测试方法：
①参比法 Yu=YS· (Fu/Fs)· (As/Au ) · (nu/ns)(A<0.05)；②直接测 量法，要求仪器有积分球
注意事项：
温度，溶剂，激发波长，浓度
应用：
量子产率取决于辐射和非辐射跃迁过程，即荧光发射、系 间跨越、外转移和内转移等的相对速率
常用物质的量子产率
Q.Y. Standards Cy3 Cy5 Cresyl Violet Fluorescein popop Quinine sulfate Rhodamine 101 Q.Y. [%] 4 27 53 95 97 58 100 Conditions for Measurement PBS PBS Methol 0.1M NaOH, 220C Cyclohexane 0.1 M H2SO4, 220C Ethanol Excitation [nm] 540 620 580 496 300 350 450
近红外荧光分析法； 荧光反应速率法
荧光显微与成像技术；空间分辨荧光技术荧光探针技术；
单分子荧光检测技术； 荧光光纤化学传感器
常用荧光探针
探针 1,8-ANS Hydroxycoumarin Aminocoumarin NBD Ex(nm) Em(nm) 372 325 350 466 480 386 445 536 探针 Cy3 Hoechst 33342 Ethidium Bromide Fluo-3 (膜穿透性) Ex(nm) Em(nm) 550 343 493 506 570 483 620 526
能量共振转移制备荧光呼吸囊泡
B) Schematic representation of the protonation and deprotonation of PEG-b-PDMA-Azo in the C) Steadystate fluorescence spectra of the vesicular solution at pH values between 4 and 12 D) Reversible pHinduced change in the fluorescence upon the alternate addition of HCl and NaOH