Solexa测序原理及流程
高通量测序技术在基因组学中的应用
高通量测序技术在基因组学中的应用序言基因组学是分子生物学的一支重要分支，主要研究细胞核中的基因组结构、功能、演化和调控等方面的科学。
借助高通量测序技术的快速发展，基因组学科研的深入开展得到了大力推动。
本文将介绍高通量测序技术在基因组学研究中的应用和成果。
第一章高通量测序技术基础高通量测序技术，也称次代测序技术，由于其高效率、低成本、快速、高覆盖度和高准确性，成为基因组学研究的重要工具之一。
目前主流的高通量测序技术主要包括Illumina/Solexa、Roche/454和ABI/SOLiD等，其中Illumina/Solexa是应用最广泛的一种。
Illumina/Solexa技术的原理是通过DNA逐个合成碱基来完成DNA测序。
具体步骤如下：首先，将待测DNA断裂成随机长度的小片段（<1kb），随后，通过序列悬挂的方式固定至芯片表面，并在芯片表面上合成这些小片段的互补链；此时，每个待测分子都被固定在芯片表面的特定位置上，称之为簇。
随后，引物和四种不同颜色的碱基（A、T、C和G）被依次引入反应体系，按照碱基与模板上互补碱基的配对规则，根据荧光信号将序列逐个测出。
一般而言，一次测序过程中可以生成成千上万条序列，每条序列为151-250 bp左右，读长在94%以上，准确度高达99.6%。
第二章高通量测序技术在基因组学中的应用1. 基因组的重测序与组装基因组序列的正确性是基因组学研究的基础。
然而，由于Illumina/Solexa技术中存在诸多偏差、误差和缺失等问题，基因组的测序和组装是难以完全避免的。
针对这一问题，高通量测序技术被广泛应用于基因组的重测序和组装。
通过对同一样品进行多次测序，便可增加基因组测序数据的深度，提高基因组组装的准确性和连续性。
如国际人类基因组计划（Human Genome Project）中，Illumina/Solexa技术曾被应用于人类基因组的测序和组装，成功解决了多个困难难题。
Solexa测序原理及实验流程
Solexa测序原理及实验流程(2011-04-19 09:45:04)Solexa 高通量测序原理Solexa 方法是利用单分子阵列测试 genotyping ，此种测序法首先是将 DNA 从细胞中提取，然后将其打断到约 100 － 200bp 大小，再将接头连接到片段上，经 PCR 扩增后制成 Library 。
随后在含有接头的芯片（ flow cell ）上将已加入接头的 DNA 片段绑定在 flow cell 上，经反应，将不同片段扩增。
在下一步反应中，四种荧光标记的染料应用边合成边测序的原理，在每个循环过程里，荧光标记的核苷和聚合酶被加入到单分子阵列中。
互补的核苷和核苷酸片断的第一个碱基配对，通过酶加入到引物上。
多余的核苷被移走。
这样每个单链 DNA 分子通过互补碱基的配对被延伸，利用生物发光蛋白，比如萤火虫的荧光素酶，可通过碱基加到引物后端时所释放出的焦磷酸盐来提供检测信号。
针对每种碱基的特定波长的激光激发结合上的核苷的标记，这个标记会释放出荧光。
荧光信号被 CCD 采集， CCD 快速扫描整个阵列检测特定的结合到每个片断上的碱基。
通过上述的结合，检测可以重复几十个循环，这样就有可能决定核苷酸片断中的几十个碱基。
Solexa 的这种方法，可在一个反应中同时加入 4 种核苷的标签，采用边合成边测序（SBS － sequencing by synthesis），可减少因二级结构造成的一段区域的缺失。
并具有所需样品量少，高通量，高精确性，拥有简单易操作的自动化平台和功能强大等特点，此反应可以同时检测上亿个核苷酸片断 , 因此在同一个芯片或几个芯片上花费很少（只需常规方法的 1 ％）的成本就可测试全基因组。
实验流程1. 文库制备将基因组DNA打成几百个碱基（或更短）的小片段，在片段的两个末端加上接头(adapter)。
2. 产生DNA簇利用专利的芯片，其表面连接有一层单链引物，DNA片段变成单链后通过与芯片表面的引物碱基互补被一端“固定”在芯片上。
高通量测序技术简介
高通量测序技术简介
高通量测序技术又称“下一代”测序技术，以能一次并行对几十万到几 百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。目前用于微生物群 落多样性研究的高通量测序平台主要有来自罗氏公司的 454法、Illumina公 司Solexa法和 ABI 的 SOLiD 法
罗氏454法测序原理
GS FLX系统的测序原理是基于焦磷酸测序法，依靠生物发光对DNA序列进 行检测。在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下， GSFLX系统将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号释放偶联起来。通过 检测荧光信号释放的有无和强度，就可以达到实时测定DNA序列的目的。
罗氏454法测序流程
Solexa测序法测序流程
• 1.添加接头：利用物理方法将待测 样品DNA打碎，在单链DNA碎片两端 加上接头
• 表面结合：Solexa的测序时利用微注 射系统将已经加过接头和待测片断随 机添加到玻璃Flow Cell内，每一个 Flow Cell又补分成8条Lane，每条 Lane的内表面上能与共价键的形式随 机固定单链接头序列和带接头的单链 待测DNA片断
四种荧光标记的染料应用边合成边测序（ Sequencing By Synthesis ） 的原理，在每个循环过程里，荧光标记的核苷和聚合酶被加入到单分子阵列中。 互补的核苷和核苷酸片断的第一个碱基配对，通过酶加入到引物上。多余的核苷 被移走。这样每个单链 DNA 分子通过互补碱基的配对被延伸，利用生物发光蛋 白，比如萤火虫的荧光素酶，可通过碱基加到引物后端时所释放出的焦磷酸盐来 提供检测信号。针对每种碱基的特定波长的激光激发结合上的核苷的标记，这个 标记会释放出荧光。荧光信号被 CCD 采集，CCD 快速扫描整个阵列检测特定的 结合到每个片断上的碱基。通过上述的结合，检测可以重复几十个循环，这样就 有可能决定核苷酸片断中的几十个碱基。
Illumina Solexa NGS
建库
即样本制备过程，将DNA打断到大小适宜的片段，在DNA片段两 端加上测序接头，完成建库工作。
首先准备基因组DNA（100—200ng），然后将DNA随机片段化 成几百碱基或更短的小片段，并在两头加上特定的接头 反转成cDNA，然后加上接头，或者先将RNA 反转成cDNA，然后再片段化并加上接头。片段的大小（Insert size）对于后面的数据分析有影响，可根据需要来选择。对于基
Illumina Solexa NGS
DNA二代测序Solexa技术
Illumina Solexa
Solexa技术最早由两位剑桥大学和Sanger的科学家创立，利用专利核心技术 “DNA簇”和“可逆性末端终结”，达成自动化样本制备及基因组数百万个碱基大 规模平行测序。 Illumina作为测序行业的龙头企业，于2006年收购Solexa公司，获得新一代高通量 测序技术，从而成为目前市场上的主流测序满足Small RNA 测序的读长要求，且数据读取量大，性价比高，因此Solexa在Small RNA测序方面得到广泛的应 用
(1) PAGE胶纯化特定大小的小RNA分子； (2) 5′接头连接和纯化； (3) 3′接头连接纯化； (4) RT-chnoli基延伸测序（Single Base Extension and Sequencing）
完成好扩增的DNA片段紧密结合在flowcell上，加入带有荧光信号的dNTP，检测与 DNA片段结合的dNTP信号来获得碱基信息。 簇扩增及测序同时进行。即在碱基延伸过程中，每个循环反应只能延伸一个正确互 补的碱基，根据四种不同的荧光信号确认碱基种类，保证最终的核酸序列质量，经 过多个循环后，完整读取核酸序列 二 RNA是一类高度保守的长度在18-30 nt的RNA分子，主要包括miRNA、siRNA、piRNA。 是生物体内一类重要的调控分子，参与细胞生长、发育、代谢、基因转录和翻译等诸多生物学 过程，在疾病的发生发展转归的病理过程中也具有非常重要的作用，是一类新的极具开发潜质 的生物标志物和药物靶标。
solexa测序原理及操作
≥99% ≥99% ＞98.5% ≥98.5%
5. Solexa 上机操作
C S
稀释样品→CS扩增→添加测序引物→送往GA测序
G A
检查GA→安装FC→First Base评估→开始测序
稀释样品
用于CS上机的样品首先经过QPCR检测浓度后根据任务单 上机密度的要求对样品进行稀释。这分为新库和旧库两种 情况：新库会根据以往类似样品的经验大概设定一个浓度； 旧库即是根据已经上机后的数据计算出相应的浓度。
读长
时间（天）
密度
产量(GB)
准确率
1 x 36 bp 2 x 36 bp 2 x 45 bp 2 x 76 bp
~2.5 ~5 ~6.5 ~9.5
138-168 million 138-168 million 138-168 million 138-168 million
4.5-6 9.5-11.5 13.5-16.5 20.5-25
diol
diol
diol
diol
diol
Flow Cell接头
P7
P5
模板杂交
延长
变性
剩下的复制链其一端“固定”在芯片上，另外一
端随机和附近的另外一个引物互补，被“固定” 住，形成“桥”(bridge) 。 形成的单链桥，以周围的引物为扩增引物，在芯 片表面进行扩增，形成双链。 双链经变性成单链，再次形成桥，并作为下一轮 扩增的模板继续扩增反应 。 反复若干轮扩增，每个单分子得到了大量扩增， 成为单克隆“DNA簇群”。
Y
X
TG C TAC GAT …
1 2 3 4 5 6
7
8
9
TTTTTTTGT…
3.2 Paired-End Sequencing
mRNA solexa测序分析方案
mRNA solexa测序结果分析SSC021目录mRNA solexa测序实验分析方案 (3)Solexa Digital Gene Expression (3)分析方案 (3)一、基因注释（必选） (3)二、差异基因筛选（必选） (4)三、样品之间的比较分析（推荐） (4)四、GO(gene ontology)分析（推荐） (4)五、pathway分析（推荐） (5)六、Knowledge-driven Network分析（推荐） (5)七、转录因子分析（推荐） (5)mRNA solexa测序实验分析方案Solexa Digital Gene Expression基因表达方法采用Illumina Digital Gene Expression试剂盒。
选取起始1～2µg总RNA，利用OligodT的beads富集总RNA样本中mRNA，并逆转录为双链cDNA，采用4碱基识别酶DpnII酶切双链cDNA，链接Illumina adapter1，利用MmeI酶切3’端20碱基，并在3’端链接Illumina adapter2。
再加入Primer GX1和Primer GX2, 进行15个循环的PCR扩增（10 seconds at 98°C， 30 seconds at 60°C，15 seconds at 72°C ，10 minutes at 72°C）。
扩增后样本通过6% TBE PAGE 胶回收85碱基条带，纯化后通过Illumina基因表达测序法测序。
分析方案一、基因注释（必选）我们将测序结果进行比对和分析，确定tag代表的基因，用于后续分析。
结果样板：二、差异基因筛选（必选）对样品之间进行差异基因筛选。
筛选到表达有差异变化的基因。
然后对变化基因的趋势进行归类，以方便分析和描述。
实例如下图：三、样品之间的比较分析（推荐）我们将通过曲线拟合的方法，寻找样品之间趋势差异最大的一些基因：四、GO(gene ontology)分析（推荐）对于每一种表达趋势的基因，选择性的进gene ontology:功能分析。
北京师范大学生物化学课件---solexa测序原理及应用
目标基因组 片段化
新一代高通量 DNA 测序技术
片段拼接
补洞
新一代 DNA 测序技术在全基因组测序应用中的技术路线
二、全基因组表达谱分析：
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基于新一代测序技术的表达谱分析原理
和附近的另外一个引物互补，被“锚定”住，形成“桥“(bridge)； 5、在测序芯片上同时有上千万 DNA 单分子发生以上的反应； 6、4 中形成的单链桥，以周围的引物为扩增引物，在测序芯片表面再次进行扩增，形
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成双链；
7、双链经变性成单链，再次形成桥，成为下一轮扩增的模板继续扩增反应；
Solexa 技术的基本原理: 1、基因组 DNA 被随机打断成为小的 DNA 片断；并在 DNA 片断的两端连上接头
(adapter)； 2、Solexa 测序专用的测序芯片（flow cell）表面连接有一层单链引物（Primer）,单链状
态的 DNA 片断与芯片表面的引物通过碱基互补被一端“锚定”在芯片上； 3、通过扩增反应使得单链 DNA 成为双链 DNA； 4、双链再次变性后成为单链，其一端“锚定”在测序芯片上，另外一端（5’或 3’）随机
Solexa 技术介绍： Solexa 技术最早由两位剑桥大学的化学家创立，利用专利核心技术“DNA 簇” 和“可逆性末 端终结”，达成自动化样本制备及基因组数百万个碱基大规模平行测序，具有高准确性，高 通量，高灵敏度，和低运行成本等突出优势。可以同时完成传统基因组学研究（测序和注释） 以及功能基因组学 （基因表达及调控，基因功能，蛋白/核酸相互作用）研究。
其他应用：DNA 甲基化分析，Metagenomics 等。
一、基因组测序和重测序： 1、经典案例
Solexa测序原理及流程_--华大基因
深圳华大基因研究院
Agenda
DNA样品制备 Cluster Formation
Binding to flowcell Bridge Amplification
SBS (Sequencing By Synthesize)
One Cycle One Base
P5
3’ddN
O
ttactatgccgctggtggctctagatgt aatgatacggcgaccaccgagatctaca
s(T)10
agtgtagatctcggtggtcgccgtatcatt
gaagagctcgtatgccgtcttctgcttgaaaaaaaaaa
NaIO4
DNA insert
Melt and hybridize 3’ to primers
5’
1st
PCR oligo 2
P7
round
PCR 5’
3’
3’ 5’
3’ extension
3’
3’
5’
3’ extension
Insert
3’ 5’
3’ 5’
P7
P5
5’ 3’
SBS oligo
P7 反向互补序列
5’ 3’ 5’
Pair End
DNA样品制备
Cluster formation
Cluster Formation
Bridge Amplification Cycle
DNA synthesization
P7 P5
SBS oligo
Sequencing By Synthesization
三种特殊序列
solexa培训的资料
基于SBS的Solexa测序技术
3’-
…-5’
5’-
GTATTTTCGGCACAG
A
G
A
C
T C
T TG
Cycle 1:按顺序加入反应试剂 合成第一个碱基 清除未反应的碱基和试剂 激发碱基荧光并收集荧光信号 去除阻断基团和荧光基团
Cycle 2-n: 重复前面的步骤
Solexa仪器说明
Solexa仪器说明
直观图
特殊处理图
6 Solexa的优势
高 通 量 ： 一 次 单 通 道 的 测 序 可 以 得 到 不 低 于 200 万 条
的序列
低成本：每20个碱基只需花费一分钱，是传统Sanger
技术花费的1/100。
高分辨率：可以检测测序得到的miRNA单个碱基差异 高精准度：数字的检测信号，从几个到数十万个copy
成复制链。
2.1.1 Cluster Station流程
剩下的复制链其一端“固定”在芯片上，另外一
端随机和附近的另外一个引物互补，被“固定” 住，形成“桥”(bridge) 。
形成的单链桥，以周围的引物为扩增引物，在芯
片表面进行扩增，形成双链。
双链经变性成单链，再次形成桥，并作为下一轮
扩增的模板继续扩增反应 。
精确计数
操作简便：不需重复实验 多用途：基因测序；重测序；mRNA；Small RNA；
甲基化DNA；多样品测序……
谢谢!
ห้องสมุดไป่ตู้
SOLEXA
新一代的基因测序技术
上机组
1 SOLEXA测序原理
Solexa 是 一 种 基 于 边 合 成 边 测 序 技 术
高通量测序技术及原理介绍
• Cluster generation
– Bridge PCR
• Sequencing on Genome Analyzer IIx
– RTA (Run Time Analysis)
• Analysis pipeline
– Offline analysis, alignment, SNPs calling, reads counting
Cluster generation: Bridge amplification
Bridge amplification cycle repeated till multiple bridges are formed
CONFIDENTIAL – DO NOT DISTRIBUTE
Cluster generation
Paired end sequencing
3’ ends are
blocked
forward strand is cleaved
CONFIDENTIAL – DO NOT DISTRIBUTE
Sequencing reverse strand
Hybridize sequencing
Perform sequencing on forward strand Re-generate reverse strand
Perform sequencing on reverse strand
CONFIDENTIAL – DO NOT DISTRIBUTE
Sample Prep - Resequencing
高通量测序技术及原理介绍
童贻刚 军事医学科学院 微生物流行病研究所 tong.yigang@
SOLEXA建库和测序过程介绍
SOLEXA建库和测序过程介绍Solexa是一种高通量测序技术，由Illumina公司开发。
它使用独特的建库和测序方法，可以同时处理大量的DNA分子，并生成数百万个序列读数。
以下是Solexa建库和测序过程的详细介绍。
建库过程：1.DNA提取：将所需测序的样本中的DNA提取出来。
可以使用常见的DNA提取方法，如酚氯仿法或商用DNA提取试剂盒。
2.DNA片段化：将提取出的DNA片段化为较短的片段。
这可以通过使用特定的切割酶来实现，也可以通过超音波处理或者热处理来实现。
3.适配体连接：为了将DNA片段固定在测序平台上，需要在DNA的两端添加适配体。
适配体是一个带有特定序列的短DNA片段，可以与测序平台上的引物结合。
适配体连接可以通过使用特定的适配体和连接酶来实现。
4.PCR扩增：适配体连接后，需要对样本中的DNA片段进行PCR扩增，以便将其扩增到足够的数量，以进行后续的测序。
PCR反应使用特定的引物，它们与适配体上的序列互补。
5.大规模扩增：得到的PCR产物经过反复的PCR扩增步骤，以确保有足够的DNA片段供测序使用。
这一步通常要进行多次循环扩增。
6.库净化：将扩增产物进行净化，去除引物和未使用的PCR试剂。
7.文库质检：通过使用生物分析仪或聚丙烯酰胺凝胶电泳等方法，对建立好的DNA文库进行质检，以确定其质量和浓度。
测序过程：1.空腔测序：将建立好的DNA文库装载到测序芯片上。
这些芯片由许多小腔组成，每个小腔内含有许多DNA团块。
2.序列扩增：使用PCR扩增方法，将每个小腔内的DNA团块扩增成数百万个DNA聚集体。
3.测序：在测序芯片上通过添加特定的DNA引物和荧光标记的核苷酸，进行测序。
这时，在每个小腔里的DNA聚集体中会生成一个较短的DNA片段，它带有一个特定的荧光标记。
4.荧光图像捕获：使用荧光成像系统，对测序芯片上的荧光标记进行图像捕获。
每一个荧光标记代表一个特定的DNA核苷酸。
5.数据分析：通过计算机软件对图像进行分析和处理，以确定每个小腔里的DNA片段的序列。
一代、二代、三代基因测序技术的发展历史及应用
备注：数据来源于罗氏官网和网络
二代测序的技术平台——Thermo Fisher
ABI/SOLiD技术原理： SOLiD测序技术也是采用油包水的方式进行Emulsion PCR。
不同之处在于SOLiD形成的小水滴要比454系统小得多， 只有1μm大小，用连接酶替代了常用的DNA聚合酶。
二代测序的技术平台——Thermo Fisher
① Ion Torrent测序芯片，是一块半导体芯片； ② 孔即是测序微珠的容器，又同时是一个微型的PH计。 ③ 4种dNTP依次流过Ion芯片； ④ 发生聚合反应产生H+引起PH变化，被传感器记录下来。 每个碱基的检测只需要几秒钟。
二代测序的技术平台——Thermo Fisher
读长
2x150bp 2x150bp 2x300bp
台式测序 2x150bp
台式测序/大规 模
2x150bp
大规模 测序
2x250bp
大规模 测序
2x150bp
测序通量 1.2Gb 7.5Gb
15Gb
120Gb
330Gb
6000Gb
16Tb
最大reads数 4M
25M
25M+
运行时间 9.5-19h 4-24h
4-55h
400M 12-30h
1.1B+ 11-48h
200亿 13-44h
260亿（单） 520亿（双）
13-48h
二代测序的技术平台——华大智造
华大基因先推出了BGISEQ-500桌面化测序系统， 之后又推出： BGISEQ-50、 MGISEQ-200、 MGISEQ-2000均取得了NMPA（原CFDA）认证， 还推出了MGISEQ-T7， 2022年10月推出DNBSEQ-T10x4、DNBSEQ-T7高通量测 序仪。
solexa测序原理
A p p l i c a t i o n NN o t e :D N A S S e q u e n c i n gClonal Single Molecule Array ™TechnologySequencing templates are immobilized on a proprietary flow cell surface designed to present the DNA in a manner that facilitates access to enzymes while ensuring high stability of sur-face-bound template and low non-specific binding of fluorescently labeled nucleotides. Solid phase amplification is employed to create up to 1,000 identical copies of each single mole-cule in close proximity (diameter of 1 micron or less). Since the process does not involve photolithography, mechanical spotting or positioning of beads into wells, the Clonal Single Molecule Array technology can achieve densities of up to 10 million single molecule clusters per square centimeter.Sequencing-by-SynthesisSolexa’s Sequencing-By-Synthesis (SBS) utilizes four proprietary fluorescently labeled modified nucleotides to sequence the millions of DNA clusters present on the flow cell surface. These nucleotides, specially designed to possess a reversible termination property, allow each cycle of the sequencing reaction to occur simultaneously in the presence of all four nucleotides (A, C, T,G). In each cycle, the polymerase is able to select the correct base to incorporate, with the nat-ural competition between all four alternatives leading to higher accuracy than methods whereonly one nucleotide is present in the reaction mix at a time. Sequences where a particular base is repeated one after another (e.g., homopolymers) are addressed like any other sequence and with high accuracy.Analysis PipelineThe Solexa sequencing approach is built around a very large number of short sequence reads.Deep sampling of more than ten-fold even coverage is required to generate a consensus and thus ensure high confidence in determination of genetic differences. Such differences are identi-fied by comparison of sequence reads to a reference. Deep sampling allows the use of weighted “majority voting” and statistical analysis, similar to conventional methods, to identify homozy-gotes and heterozygotes and to distinguish sequencing errors. Each raw read base has an assigned quality score so that the software can apply a weighting factor in calling differences and generating confidence scores.The suite of software from Solexa will enable users to align sequences to a reference in rese-quencing applications. Developed in collaboration with leading researchers, Solexa’s software suite includes the full range of data collection, processing, and analysis modules to streamline collection and analysis of data with minimal user intervention. The open format of the software allows for easy access to the data at various stages of processing and analysis using simple application program interfaces.本页已使用福昕阅读器进行编辑。
基因组测序原理
参考文献： 岳桂东 高强 高通量测序技术在动植物研究领域中的应用 生命科学 2012年第42卷 陈 勇 柳亦松 曾建国 ，植物基因组测序的研究进展 生命科学研究 2014.2 杨晓玲 施苏华 唐恬新一代测序技术的发展及应用前景 生物技术通报 2010年第10期 周晓光 任鲁风 李运涛 张猛 俞育德, 于军 下一代测序技术: 技术回顾与展望 生命科学
原理: 利用合成测序理论，将样本DNA的单链分子绑定在该仪器特有的没有背景荧 光的玻璃表面，通过加入荧光标记的核苷酸和聚合酶到单分子阵列中，核苷酸会特异 性结合到DNA分子的结合位点上 通过激光激发结合在DNA子上的荧光标记的核苷酸， 从而使标记物发出荧光，相机以15ms速度快速扫描整个阵列，检测特异性结合到DNA 片段上的荧光碱基 之后，结合的核苷酸会被移除，然后，进入下一次结合。 优缺点：不需要PCＲ扩增，所以能反映样本的真实情况，通量也较高， 但由于该技术限制可读的DNA片段长度平均仅为32bp，而且其高度精密 的显微镜不仅造成其仪器庞大价格昂贵，而且对环境要求高升级困难。
优点：纳米级别的孔径保证了检测具有良好的持续性，测序的准确度 可达 99.8%以上 ，对于长达1000bp的单链DNA分子、RNA分子或者更短的核酸分子 而言，无需进行扩增或标记就可以使用纳米孔测序法进行检测，这使得便宜 快速地进行DNA测序成为可能。
三代测速技术的比较
第一代测序技术： 凭借其长的序列片段和高的准确率, 适合对新物种进行基因组长距框架的 搭建以及后期GAP填补, 但是成本昂贵, 而且难以胜任微量 DNA 样品的测序工 作。 第二代测序技术： 454 适合对未知基因组从头测序, 搭建主体结构, 但在判断连续单碱基重 复区时准确度不高。Solexa具有通量高、片段短、价位低的特点,适合于小片段 如miRNA 的研究。 SOLID 具有双碱基编码系统的纠错能力以及较高的测序通 量, 但无法在基因组拼接中的广泛应用。
Sanger&Solexa测序原理和流程
测序的发展方向质量Fra bibliotek通量 读长成本
Quality file(Fasta)
>203c04_0102.g1.abi 21 21 29 26 26 26 32 32 33 47 48 48 51 51 42 42 56 56 56 56 48 31 31 31 31 35 42 48 37 40 36 45 35 35 35 44 56 56 42 42 36 35 51 51 56 56 56 56 56 35 35 35 29 29 17 29 35 35 35 37 42 42 44 42 37 42 44 44 56 37 42 35 36 30 33 33 38 37 37 37 31 29 29 29 42 35 29 29 29 29 29 16 17 17 24 24 29 29 682 33 47 51 46 48 44 56 51 32 45 35 35 56 42 31 40 46 43 37 37 38 36 24 24 29 42 23 29 48 42 44 51 45 35 44 39 43 37 36 28 29 33 17 48 51 35 34 42 42 42 42 42 42 35 37 46 43 45 40 43 42 37 37 36 36 28 28 35 29 40 40 430 51 51 34 34 42 42 42 42 37 37 37 37 42 40 42 40 42 42 46 51 42 42 36 42 25 25 40 40 ABI 46 42 34 34 42 42 40 45 37 37 40 51 40 45 42 37 42 42 44 43 44 37 44 42 32 27 25 25 42 42 35 37 44 51 45 35 42 42 37 42 25
报告1：Solexa测序原理、实验流程课件
1、Prepare genomic DNA sample
利用物理方法将待测样品DNA随机打断成
100-200bp的片段，在打断后的DNA片段的两 端加上接头，解开双链。
2、Attach DNA to surface
Solexa在测序时利用微注射系统将已经加过
接头的单链待测片段随机结合到Flow Cell的内表 面，每一个Flow Cell又被分成８条Lane，每条 Lane的内表面上能通过共价键的形式随机固定单 链接头序列和带接头的单链待测DNA片段。
通过变性，释放出互补的单链，固定到附近
的固相表面。
6、Complete amplification
通过不断的循环，就会在Flow cell 的固相 表面上获得上百万条成簇分布的双链待测片段。
7、Determine first base
加入DNA聚合酶、被荧光标记的dNTP和 接头引物，开始第一轮测序。
3、Bridge amplification
在Flow cell内加入未标记的dNTP和酶，起始 固相桥扩增。
4、Fragments become double-stranded
所有的单链桥型待测片段通过酶的作用，被
扩增成双链桥片段。
5、Denature the double-satanded molecules
Solexa测序原理、实验流程以及现在常 用的微生物群落功能基因检测的方法
第一部分
Solexa测序原理、实验流程
Solexa简介
Illmina 公司包含有HiSeq 和MiSeq 测序平台，基于Solexa 技术，其
基本原理是单分子簇边合成边测序(Sequencing by Synthesis，SBS)
RNA-seq技术原理和应用
1、RNA-seq技术简介 2、RNA-seq技术原理 3、RNA-seq成果分析 4、RNA-seq技术应用
1.诞生于 20 世纪 70 年代旳 Sanger 法是最早被广 泛应用旳 DNA 测序技术，也是完毕人类基因组计 划旳基础。
2. 2023 年以来，以 Roche 企业旳 454 技术、 Illumina 企业旳 Solexa 技术和 ABI 企业旳 SOLiD 技术为标志旳新一代测序技术相继诞生，又称作深 度测序技术。
3. 选择性剪接事件辨认和剪接异构体体现水平推断
只要测序深度足够深，就能检测到全部转录本旳全 部序列，涉及来自剪接接合区旳序列。Tophat 等软件 定位剪接接合区读段旳策略能标定出剪接事件中旳两 个剪接位点：供体位点和受体位点。经过比较供体位 点和受体位点旳组合，就能辨认选择性剪接事件。
进一步，经过对供体和受体位点旳读段计数，结合 外显子其他区域旳读段数据，还能定量地计算选择性 剪接事件之间旳百分比。
高通量测序技术旳应用面非常广，RNA-seq 只是 其中一种方面，除此之外，基因组旳从头测序和重 测序 、染色质免疫沉淀测序、甲基化测序等技术都 一样有着广泛旳应用。
序列多态性研究等，RNA-seq也具有很大旳潜力。
3、非编码区域功能研究 转录组学研究旳一种主要方面就是发觉和分
析 ncRNA，在表观遗传、转录及转录后等多种层面 调控基因体现。
4、基因体现水平研究 RNA-Seq一种尤其强大旳优势是它能够捕获不同 组织或状态下旳转录组动态变化而无需对数据集进 行复杂旳原则化。
3.把高通量测序技术应用到由 RNA 逆转录生成 旳 cDNA 上，从而取得来自不同基因旳RNA 片段在 特定样本中旳含量，这就是 RNA测序或 RNA-seq。
一代、二代、三代测序技术
一代、二代、三代测序技术(2021-01-22 10:42:13)转载▼第一代测序技术-Sanger链终止法一代测序技术是20世纪70年代中期由Fred Sanger及其同事首先创造。
其根本原理是，聚丙烯酰胺凝胶电泳能够把长度只差一个核苷酸的单链DNA分子区分开来。
一代测序实验的起始材料是均一的单链DNA分子。
第一步是短寡聚核苷酸在每个分子的相同位置上退火，然后该寡聚核苷酸就充当引物来合成与模板互补的新的DNA链。
用双脱氧核苷酸作为链终止试剂〔双脱氧核苷酸在脱氧核糖上没有聚合酶延伸链所需要的3－OH基团，所以可被用作链终止试剂〕通过聚合酶的引物延伸产生一系列大小不同的分子后再进行别离的方法。
测序引物与单链DNA模板分子结合后，DNA聚合酶用dNTP延伸引物。
延伸反响分四组进行，每一组分别用四种ddNTP〔双脱氧核苷酸〕中的一种来进行终止，再用PAGE分析四组样品。
从得到的PAGE胶上可以读出我们需要的序列。
第二代测序技术-大规模平行测序大规模平行测序平台〔massively parallel DNA sequencing platform〕的出现不仅令DNA测序费用降到了以前的百分之一，还让基因组测序这项以前专属于大型测序中心的“特权〞能够被众多研究人员分享。
新一代DNA测序技术有助于人们以更低廉的价格，更全面、更深入地分析基因组、转录组及蛋白质之间交互作用组的各项数据。
市面上出现了很多新一代测序仪产品，例如美国Roche Applied Science公司的454基因组测序仪、美国Illumina公司和英国Solexa technology公司合作开发的Illumina测序仪、美国Applied Biosystems公司的SOLiD 测序仪。
Illumina/Solexa Genome Analyzer测序的根本原理是边合成边测序。
在Sanger等测序方法的根底上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。
DNA的测序方法原理及其应用
DNA的测序方法原理及其应用DNA测序是一种重要的分子生物学技术，可以确定DNA序列，从而揭示生物遗传信息的基本单位。
DNA测序技术的发展，使得我们能够对个体的基因组进行全面的研究和解析。
本文将介绍DNA测序的几种常用方法、原理及其应用。
DNA测序方法：1. 脱氧链终止法（Sanger法）：该方法是最早也是最经典的DNA测序方法。
它利用DNA聚合酶合成DNA链的特性，通过添加一小部分有色荷兰猪被星状的二进制碱基（比如dideoxy链终止核苷酸）来实现。
从而使得在每个碱基位置上，只有一种类型的碱基被加入到扩增产品中。
最后，通过电泳分离不同长度的扩增产物，便可以得到DNA的序列信息。
2. 测序微阵列：这是一种高通量测序方法，它利用液相法合成DNA 片段，然后通过特定的连接方法将其固定在芯片上，形成微阵列。
以Illumina公司的Solexa技术为例，该技术采用先进的合成法和荧光标记法，通过逐步的碱基加入和扩增来合成特定长度的DNA片段，并利用不同颜色荧光标记具有不同碱基的DNA片段。
最后，通过高分辨率成像仪读取芯片上每个碱基位置上的荧光信号，得到DNA的序列信息。
3. 单分子实时测序：这是一种最新的测序技术。
他利用聚合酶酶活性而不需要离体化学反应实现测序。
其中，Pacific Biosciences公司的测序平台是其中较为流行的实时测序技术，它利用DNA聚合酶合成链的时候伴随释放出的底物荧光信号，来实时监测DNA的合成过程，从而获得DNA的序列信息。
DNA测序原理：DNA测序的核心原理都是通过测量DNA合成过程中的信号变化，来确定每个碱基的序列。
脱氧链终止法是基于合成DNA链的特性，它通过添加一个低浓度的二进制链终止核苷酸来限制DNA聚合酶的合成，从而在特定位置上引入链终止，完成DNA的扩增和分离。
测序微阵列和单分子实时测序则利用荧光信号的变化来获取序列信息，因为荧光标记的碱基在合成时会释放出荧光信号。
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P5
Linearization of Clusters
NaIO4
caagcagaagacggcatacgagctcttc stttttttttt
gagaaagggatgtgctgcgagaaggctaga ctctttccctacacgacgctcttccgatct
aaaaaaaaaagttcgtcttctgccgtatgctcgagaagg caagcagaagacggcatacga tttttttttt caagcagaagacggcatacgagctcttcc s
Solexa测序原理及流程
深圳华大基因研究院
Agenda
DNA样品制备 Cluster Formation
Binding to flowcell Bridge Amplification
SBS (Sequencing By Synthesize)
One Cycle One Base
Pair End
3’ extension
melt
hybridize
P5
P7
P5 P7
P7 P5
P7 P5
3’ddN
O
ttactatgccgctggtggc ttactatgccgctggtggctctagatgt aatgatacggcgaccaccg aatgatacggcgaccaccgagatctaca
s(T)10
7. Linearise P7 (Fpg)
SBS READ 2
6. Re-synthesis of P5-strand (Isothermal amp)
5. De-phosphorylate P5-PO4(PNK)
Specification comparison:
Single read Flowcell Linearisation Blocking 1 Blocking 2 Sequencing primer R2 preparation SBS kit 36 cycle SBS3(+T) SBS3(+T) 15 reagents 36 cycle SBS8(+T) 4 h 50 mins 36 cycle 2 primer Diol 2-primer PE method Read 1 Read 2
5’ 3’ 3’
3’ extension
3’
5’
3’ extension
Insert
3’ 5’ 3’ 5’
5’ 3’ 5’ 3’
P7 P5 SBS oligo P7 反向互补序列
5’ 3’
PCR enrichment (cont.)
3’ 5’
Melt and hybridize to primers
Genomic DNA
sample prep
Fragment DNA
5’ 3’ 5’ + 5’ 3’ 5’ 5’ + 3’ 3’ 5’
1.End repair
T4 polymerase , DNA Pol 1 (Klenow fragment)
SBS oligo P7 反向互补序列
Phosphorylation T4 polynucleaotide kinase, ATP
tctagc agatcg
P7 NaIO4
ctaga gatct
P7
3’ddN
DNA insert
tctagccttctcgcagcacatccctttc agatcggaagagcgtcgtgtagggaaag
P5
O
Linearization of Clusters (cont.)
denature
2nd round PCR
3’
Insert
3’ extension
5’ 3’ 5’ 3’
PCR oligo 2
5’ 3’ 5’
PCR oligo 1
SBS oligo P5
5’ 3’
Melt and hybห้องสมุดไป่ตู้idize to primers
2nd round PCR
3’ 5’
P7
Cluster template
DNA样品制备
Cluster formation
Cluster Formation
Bridge Amplification Cycle
DNA synthesization
P7
SBS oligo
P5
Sequencing By Synthesization
三种特殊序列
P7序列：flowcell上结合的序列，边合成边边 测序（SBS）过程模板序列的5’端。 P5序列：flowcell上结合的序列。 SBS引物序列(oligo)
O
aatgatacggcgaccaccg aatgatacggcgaccaccgagatctacact
s(T)10
agtgtagatctcggtggtcgccgtatcatt cggtggtcgccgtatcatt
gaagagctcgtatgccgtcttctgcttgaaaaaaaaaa
O
DNA insert
tctagc
gatct
agatcggaagagcgtcgtgtagggaaag
agtgtagatctcggtggtcgccgtatcatt cggtggtcgccgtatcatt
P7
3’ddN
O
s(T)10
stttttttttt
3’ddN
O
s(T)10
hybridization of sequencing primer
2 (different) primer USER Fpg
THE END!
THANKS!
Pair End
Standard sample prep
P5 SBS3
5’
Paired-end sample prep
P5 PESP#2
5’ 5’
Insert
P7
Insert
PESP#1 P7
5’
Different Cluster template
OVERVIEW OF THE METHOD
= PO4
-
OH
8oxo-G
OH
U
OH
U
USER OH
U
OH
OH
PNK
8oxoG-P7
U-P5
1. Grafting
2. Cluster ampn
3. USER Linearisation
4. ddNTP (⊗) block & ⊗ Hyb SBS 3
SBS READ 1
Fpg
OH
OH OH OH
8. ddNTP block & Hyb SBS 8
5’po4 3’ 3’ po45’
2.Add 3’ Adenosine with
Klenow (3’exo- ) and dATP
5’po4 3’A A3’ po45’ 3’ 5’po4 3’T 5’ P7反向互补序列 反向互补序列 3’
+
3.Ligation of adaptors
5’ DNA insert
DNA insert DNA insert
caagcagaagacggcatacgagctcttc stttttttttt
P7
caagcagaagacggcatacga caagcagaagacggcatacgagctcttcc
gagaaagggatgtgctgcgagaaggctaga ttactatgccgctggtggc ttactatgccgctggtggctctagatgt
Insert
5’
5’
OH
3’ 3’ P7
OH
3’
OH
3’
OH
3’
diol
3’ P5
NaIO4
diol
P7
NaIO4
diol
P7
P5
P5
Bridge Amplification
ddNTP P5 P7
ddNTP P5 P7
SBS (Sequencing By Synthesize)
Bridge Amplification
SBS oligo
5’
3’
P7 P5 SBS oligo
5’
PCR enrichment
3’
P7 反向互补序列
3’
5’
PCR oligo 1
5’ 5’ 3’
Melt and hybridize to primers
1st round PCR
PCR oligo 2
5’ 3’ 3’ 5’
P7
P5 SBS oligo