食品安全检测技术课程实习

食品安全检测技术
课程实习
1、用高效液相色谱法测定饮料中的苯甲酸（13号上午）
一．实验目的
通过对高效液相色谱法测定饮料中的苯甲酸,掌握采用高效液相色谱法进行定性及定量分析的基本方法.
二．实验原理
苯甲酸是食品行业通用的防腐剂，据科学报道，目前影响我们食品安全的最大问题是食品腐败和微生物的繁殖，正是由于食品中使用了防腐剂，而使我们避免了更多食品中的不安全因素。

面粉中添加了增白剂最终转化成的苯甲酸不超过60ppm，我国GB2760－1996《食品添加剂卫生使用标准》中规定，苯甲酸在酱油、醋中的最大使用量为1000ppm，葡萄酒中为800ppm，碳酸饮料中为200ppm。

苯甲酸是我国目前最常用的食品防腐剂，其主要作用是防止由微生物的活动而引起的食品变质。

其分子式为：
本实验以汽水为样品,超声除去二氧化碳,调PH至中性,过滤后进入高效液相色谱,经反相色谱分离后,根据保留时间和峰面积进行定性和定量。

三．仪器和试剂
1．高效液相色谱仪，VWD（254nm）检测仪。

2．色谱柱：C18
3．超声波发生器或水泵(用于过滤或排气) 4．注射器：50微升
5．容量瓶：100ml若干6．移液管：2mL、4ml、8ml
7．流动相：甲醇：乙酸+乙酸氨（PH=3.5）=60：40，制备前，先调节水(用酸或缓冲盐)的PH=3.5，进入系统色谱前，用超声波发生器或水泵脱气。

四．实验步骤：（ESTD法）
1．标准储备液的配置：准确量取0.144克苯甲酸钠试剂，用纯水或去离子水溶解，定容到100毫升，浓度为1.44mg/ml.分别取此标准液5ml，2.5ml，1ml,0.5ml稀释为10ml，则浓度分别为0.72mg/ml，0.36mg/ml，0.144mg/ml，0.072mg/ml。

2．打开计算机，开仪器，稳定后，打开桌面的ONLINE工作站。

设定方法：设置泵的流速为1ml/min，柱温为室温（40度左右），停止时间为4min，流动相比例（甲醇：水=60；40），当流动相通过色谱柱约5-10min，记录仪上基线稳定后，开始进样。

3．进样：进样阀放在装载的位置上，用注射器取25微升浓度最低的标准样（比进样阀上的定量环多5-10微升以上），注入进样阀中。

4．进样阀从装载转向进样位，按进样按扭，工作站开始记录出图11。

5．苯甲酸的色谱峰出完后，按照4-5步骤连续操作四次，获得从最低浓度到最高浓度的标准试液的五张色谱图，分别为11，12，13，14，15（15为流动相进样，设浓度为0mg/ml）。

6．按照4-5步骤取25微升的样品，进样，出谱图W1。

五．数据分析
1. 根据标准样品色谱图中的保留时间，找到并标出饮料色谱图中的苯甲酸的色谱峰位置。

2．根据图11，12，13，14，15的浓度和峰面积，作苯甲酸的标准曲线，在标准曲线，求得未知中苯甲酸的浓度。

2、蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速检测
酶抑制率法（分光光度法）(16号上午）
一、目的要求：学习酶抑制率法测定果蔬有机磷和氨基甲酸脂类农药残留的原理和方法，注意实验过程的操作要点。

二、实验原理：
根据有机磷和氨基甲酸酯类农药能抑制乙酰胆碱酯酶的活性原理，向蔬菜的提取液中加入生化反应底物碘化乙酰硫代胆碱和乙酰胆碱酯酶，如果蔬菜不含有机磷或氨基甲酸酯类农药残留或残留量低，酶的活性就不被抑制，实验中加入的底物就能被酶水解，水解产物与加入的显色剂反应产生黄色物质。

如果蔬菜的提取液含有农药并残留量较高时，酶的活性被抑制，底物就不被水解，当加入显色剂时就不显色或颜色变化很小。

用分光光度计在412nm处或农药残毒快速检测仪测定吸光值，根据计算出的抑制率，就可以判断蔬菜中含有机磷或氨基甲酸酯类农药残留量的情况。

三、实验试剂和仪器：
（一）试剂
1、pH8.0缓冲液分别称取11.9g无水磷酸氢二钾与3.2g磷酸二氢钾，溶解于1000 mL蒸馏水中。

2、乙酰胆碱酯酶（实验专用酶）根据酶活力用缓冲溶液溶解，3 min的吸光值变化ΔA0值应控制在0.3以上。

摇匀后在0~5℃冰箱中保存，保存期不超过4天。

3、底物碘化乙酰硫代胆碱称取25.0 mg碘化乙酰硫代胆碱，用3.0 mL缓冲溶液溶解，在0~5℃下保存。

保存期不超过2周。

4、显色剂分别称取160 mg二硫代二硝基苯甲酸和15.6 mg碳酸氢钠，用20 mL缓冲溶液溶解，4℃冰箱保存。

5、可选用由以上试剂配置的试剂盒。

乙酰胆碱酯酶的ΔA0值应控制在0.3以上。

（二）仪器
1、分光光度计或相应的农残快速检测仪；
2、天平（0.01g）；
3、恒温水浴或恒温培养箱。

四、实验步骤：
1、样品处理
选取有代表性的蔬菜样品，去掉不可食部分后称取蔬菜试样，冲洗掉表面泥土，剪成1 cm左右碎片。

取样品1 g，放入烧杯或提取瓶中，加入5 mL缓冲液，振荡1~2 min，倒出提取液，静置3~5 min，待用。

2、对照溶液测试
先于试管中加入2.5 mL缓冲液，再加入0.1 mL酶液、0.1 mL显色剂。

摇匀后于37 ℃放置15 min以上（每批样品的控制时间应一致）。

加入0.1 mL底物摇匀，此时检液开始显色反应，应立即放入比色皿中，记录反应3 min的吸光度的变化值ΔA0。

3、样品溶液测定
先于试管中加入2.5 mL样品提取液，其他操作与对照测定相同，记录反应3 min的吸光度的变化值ΔA t。

五、结果计算：
抑制率（%）=1000
0⨯∆∆-∆A A A t 式中 ΔA 0——对照液反应3 min 吸光度的变化值；
ΔA t ——样品溶液反应3 min 吸光度的变化值。

六、实验结果判断：
当蔬菜样品提取液对酶的抑制率大于50% 时，表示样品中有高剂量的有机磷或氨基甲酸酯类农药残留，可判定样品为阳性结果，对检验结果阳性的样品需重复检验两次以上。

1、对检验结果阳性的样品，需用其他方法进一步确定残留农药的种类和进行定量测定。

3、葱、蒜、萝卜、韭菜、香菜、茭白、蘑菇和番茄汁液中，含有对酶有影响的植物次生物质，容易产生假阳性，处理样品时，可采取整株（体）蔬菜浸提或采用表面测定法。

对一些含叶绿素较高的蔬菜，也可采取整株（体）蔬菜浸提法，减少色素的干扰。

4、当温度条件低于37℃，酶反应速度随之放慢，药片加液后放置反应的时间也应相对延长，延长时间的确定，应以胆碱酯酶空白对照测试的吸光度变化 ΔA 0在0.3以上为准。

注意样品放置时间应与空白对照溶液放置时间一致才有可比性。

酶的活性不够和温度太低都可能造成胆碱酯酶空白对照液3 min 的吸光度ΔA 0变化值＜0.3。

5、该法适用于大量蔬菜样本的筛检，不适用于最后的仲裁检测。

3、火腿中亚硝酸盐的测定（16号下午）
1检验原理
GDYQ—901SC2食品亚硝酸盐快速测定仪的原理是基于被测样品中亚硝酸盐与对氨基苯磺酸反应生成稳定化合物，再与N-1-萘基乙二胺作用生成紫红色络合物对可见光有选择性吸收,可在仪器上直接显示出被测样品中亚硝酸盐的含量。

2检验仪器与试剂
2、1亚硝酸盐试剂（一）
2、2亚硝酸盐试剂（二）
2、3亚硝酸盐试剂（三）
2、4亚硝酸盐试剂（四）
2、5亚硝酸盐试剂（五）
2、6亚硝酸盐快速测定仪
2、7硝酸
2、8高氯酸
2、9硫酸
所用试剂均为分析纯。

主要仪器：定氮瓶、电炉、水浴锅
3操作方法
3、1 样品处理
称取10.00g或20.00g样品（或吸取10.0 mL或20.0 mL液体样品）置于250～500 mL定氮瓶中，加数粒玻璃珠、5～15 mL硝酸-高氯酸混合液。

放置片刻，小火缓缓加热，待作用缓和，放冷。

沿瓶壁加入5 mL或10 mL硫酸，再加热，至瓶中液体开始变成棕色时，不断沿瓶壁滴加硝酸-高氯酸混合液至有机质分解完全。

加大火力，至产生白烟，待瓶口白烟冒净后，瓶内液体再产生白烟为消化完全，该溶液应澄明无色或微带黄色，放冷。

在操作过程中应注意防止爆沸或爆炸。

加20 mL水煮沸，除去残余的硝酸至产生白烟为止，如此处理两次，放冷。

将冷后的溶液移入50 mL或100 mL容量瓶中，用水洗涤定氮瓶，洗液并入容量瓶中，放冷，加水至刻度，混匀。

定容后的溶液每10 mL相当于1g样品，相当加入硫酸量1 mL。

取与消化样品相同量的硝酸-高氯酸混合液和硫酸，按同一方法做试剂空白试验。

3、2 测量操作
3.2.1选择“测量”项目，按键。

仪器显示为：
旋紧试剂空白比色瓶（蓝色刻度线）定位器，擦净比色瓶外壁，放入比色槽中锁定，按键，仪器发出“嘟……”一声，出现画面为：
3.2.2取下空白比色瓶（蓝色刻度线），旋紧样品比色瓶（白色刻度线）定位器，擦净比色瓶外壁，将样品比色瓶放入比色瓶槽中锁定。

按键，仪器发出“嘟……”一声响，出现画面为：
画面上出现的数值即为样品中亚硝酸盐的含量。

根据测量情况可以选择“保存”(按键)或“不保存”(按键)。

如按键，此数据就被保存，在“记录”中就可以查到此数据。

如果还有样品要测定，可以换上所要测定的样品比色瓶。

按键进行测量，可以不重新测量试剂空白。

3.2.3结果判定
当被测样品中亚硝酸盐含量超过国家允许限量时（快速初筛法），应采用国标改良法对样品进行重复检测，进一步确定检测结果。

如果检测结果继续超过国家允许限量时，必须送有资质条件的质检部门进行确认或裁决。

4记录与数据处理
部分食品中亚硝酸盐的限量标准（以NaNO2计）
品名限量标准mg/kg
食盐（精盐）、牛乳粉≤2
香肠（腊肠）香肚、酱腌菜、广式腊肉≤20
鲜肉类、鲜鱼类、粮食≤3
肉制品、火腿肠、灌肠类≤30
蔬菜≤4
其他肉类罐头、其他腌制罐头≤50
婴儿配方乳粉、鲜蛋类≤5
西式蒸煮、烟熏火腿及罐头、西式火腿罐头≤70
4、原子吸收分光光度法测菜叶中镉的含量（17号上午）
1、原理
样品经处理后,在pH6左右的溶液中, 镉离子与双硫腙形成络合物, 并经乙酸丁酯萃取分离, 导入原子吸收仪中, 原子化以后, 吸收228.8nm共振线, 其吸收量与镉量成正比,与标准系列比较定量。

2、试剂
3、要求使用去离子水, 优级纯或高级纯试剂。

4、2.1 混合酸: 硝酸与高氯酸按3:1混合。

2.2 1N盐酸：量取10mL盐酸加水稀释至120mL.
2.3 5N盐酸：量取50mL盐酸加水稀释至120mL。

2.4 2M柠檬酸钠缓冲液: 称取226.3g柠檬酸钠及48.46g柠檬酸,加水溶解, 必要时, 加温助溶, 冷却后加水稀释至500mL。

临用前用0.1%双硫腙-乙酸丁酯溶液处理以降低空白值。

2.5 0.1%双硫腙-乙酸丁酯溶液: 称取0.1g双硫腙, 加10mL三氯甲烷溶解后, 再加乙酸丁酯稀释至100mL, 临用时配制。

2.6 氨水。

2.7 镉标准溶液：精密称取1.0000g金属镉(99.99％)，溶于20mL5N盐酸中, 加入2滴硝酸后，移入1000mL容量瓶中，以水稀释至刻度，混匀。

贮于聚乙烯瓶中。

此溶液每毫升相当于1mg镉。

2.8 镉标准使用溶液：：吸取10.0mL镉标准溶液,置于100mL容量瓶中,以1N盐酸稀释至刻度，混匀。

如此多次稀释至每毫升相当于0.2μg镉。

3 仪器
原子吸收分光光度计。

4 操作方法
4.1样品处理
蔬菜、瓜果类：取可食部分洗净晾干，切碎充分混匀。

称取5g上述样品，置于250mL高型烧杯中，加15mL混合酸, 盖上表面皿，放置过夜，再于电热板或砂浴上加热消化，消化过程中，注意勿使干涸，必要时再加少量硝酸，直至溶液澄明无色或微带黄色。

冷后加25mL水煮沸，除去残余的硝酸至产生大量白烟为止，如此处理两次，放冷。

以25mL水分次将烧杯内容物移入125mL分液漏斗中。

取与处理样品相同量的混合酸，硝酸按同一操作方法做试剂空白试验。

4.2 萃取分离
吸取0、0.25、0.50、1.50、2.50、3.50、5.0mL镉标准使用液(相当0、0.05、0.1、0.3、0.5、0.7、1.0μg镉), 分别置于125mL分液漏斗中, 各加1N盐酸至25mL。

于样品处理溶液、试剂空白液及镉标准溶液各分液漏斗中各加5mL2M柠檬酸钠缓冲液,以氨水调节pH至5～6.4, 然后各加水至50mL, 混匀。

再各加5.0mL0.1%双硫腙-乙酸丁酯溶液,振摇2min, 静置分层, 弃去下层水相, 将有机层放入具塞试管中, 备用。

4.3 测定
将有机相导入火焰进行测定, 测定条件: 灯电流6～7mA, 波长228.8nm, 狭缝0.15～0.2nm,空气流量5L/min,乙炔流量0.4L/min, 灯头高度1, 氘灯背景校正(也可根据仪器型号,调至最佳条件),以镉含量对应浓度吸光度, 绘制标准曲线比较。

4.4 计算
(A3-A4)×1000
X2 = ────────── (2)
m2×1000
式中:X2——样品中镉的含量,mg/kg;
A3——测定用样品中镉的含量,μg;
A4——试剂空白液中镉的含量,μg;
m2——样品质量, g。