层析分离纯化技术策略共57页
凝胶层析法分离纯化蛋白质PPT课件
三、平衡
将洗脱液与恒流泵相连，恒流泵出口端与层析柱入口相连，用2～3倍柱床体积 的洗脱液平衡，流速为0.5ml/min。
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四、加样与洗脱
将柱中多余的液体放掉出，使液面刚好盖过凝胶，关闭出口，将1ml样品沿 层析柱管壁小心加入，加完后打开底端出口，使液面降至与凝胶面相平时关闭出 口，加洗脱液至液层4cm左右，接上恒流泵，开始洗脱（ 0.5ml/min）。
第1页/阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分 子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离的技术。
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凝胶过滤层析
凝胶层析是按照蛋 白质分子量大小进行分 离的技术，又称之凝胶 过滤、分子筛层析或排 阻层析。
单个凝胶珠本身象 “筛子”。不同类型凝 胶的筛孔的大小不同。
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五、收集与测定
用部分收集器收集洗脱液。紫外检测仪280nm处检测，将检测信号输入色谱 工作站系统，绘制洗脱曲线。
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六、凝胶柱的处理
凝胶用过后，反复用蒸馏水通过柱（2~3倍床体积）即可。
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注意事项
• 各接头不能漏气，连续用的小乳胶管不要有破 损，否则造成漏气、漏液。注意恒压瓶内的排 气管应无液体，并随着柱下口溶液的流出不断 有气泡产生，则表示恒压瓶不漏气。操作过程 中，层析柱内液面不断下降，则表示整个系统 有漏气之处，应仔细检查并加以纠正。
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【实验器材】 ➢ 层析柱 ➢ 恒流泵 ➢ 紫外检测仪 ➢ 部分收集器 ➢ 试管等普通玻璃器皿
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第三章 蛋白质的分离纯化-层析技术
第五节层析技术简介蛋白质分离纯化中的层析技术是基本工具⏹层析（chromatography）是最有效的分离手段，也是最重要的蛋白质纯化工具。
层析主要是物理方法，是混合熵减少的过程，必然消耗自由能。
⏹基因工程下游的核心是层析。
⏹层析技术的理论与实践已高度发展和完善。
层析的概念在把微细分散的固体或是附着于固体表面的液体作为固定相，把液体（与上述液体不相混合的）或气体作为移动相的系统中，使样品中的各成分边保持向两相分布的平衡状态边移动，利用各成分对固定相亲和力不同所引起的移动速度差，将它们彼此分离开的定性与定量分析方法，称为层析，亦称色谱法。
根据移动相种类的不同，分为液体层析、气体层析二种。
层析的类型◆分配层析：固定相与流动相之间对待分离组分溶解度的差异来实现分离。
◆吸附层系：利用被分离组分对固定相表面吸附中心吸附的能力的差别即吸附系数的差别而实现分离。
如亲和、疏水、金属螯合、离子交换等相关杂质◆目标产物相关杂质：聚集体（抗体）、片段◆过程相关杂质和污染物：宿主细胞蛋白：免疫测定宿主细胞DNA：DNA杂交、QPCR、DNA结合预知分析、荧光测定-picogneen细胞培养基蛋白质：病毒：QPCR、电子显微镜、体内体外分析（逆转录酶）微生物：生菌数实验、内毒素实验◆其他种类杂质或污染物：层析柱、容器的沥出物；可抽提物；细胞培养基组分；纯化中使用的试剂；蛋白质层析介质基体须具备的特性◆生物兼容性：亲水性，大孔径不会使生物大分子失活，没有生物化学毒性--过强吸附，泄漏.◆化学稳定性：在生物大分子存在的化学条件下是稳定的。
pH,络合物,氧化还原性,巯基化合物……◆必要的机械性能: 流体中的耐压性，弹性化学组成: 亲水多孔高聚物等◆天然高分子多糖:纤维素、交联葡聚糖、琼脂糖及其共聚物----孔径分布宽、较软◆合成高聚物:聚丙烯酰胺类、聚丙烯酸脂类、聚乙二醇聚、丙烯酸脂共聚物、亲水性处理的聚苯乙烯类（都是交联大孔高聚物）◆无机化合物: 硅胶、羟基磷灰石、氧化锆聚合物基体(matrix)孔的结构◆多孔结构：内表面占整个表面积的95% 以上◆孔径分布: 分配层析要求分布宽、均匀，相应于低交联度◆高交联度导致孔径分布偏向高，介质本身微观不均匀性变大，适合大孔径高硬度吸附层析孔的结构可分为三种类型标志产品:◆SepharoseHP,ToyopearlSepharoseHP,Toyopearl;MacroPrep,UNOSphere,FractogelEMD,SourceMacroPrep,Source ◆UNOQUNOQ，POROSBeads 结构：典型层析介质的放大观察Confocal Microscopy ImagesMonolith 结构示意图方案的特点◆捕获（Capture）：离子交换、疏水、金属螯合、亲和、分配层析◆中间纯化：离子交换、疏水、金属螯合、亲和、分配层析◆精制：离子交换、疏水、金属螯合、亲和、分配层析◆样品中的污染物：核酸、胆固醇、甘油三脂、磷脂、脂肪酸、小分子络合物、金属离子◆层析步骤间的过渡方式：如离子交换接疏水动物组织中蛋白质的例子◆组织匀浆1:4（w/v）◆匀浆后蛋白浓度：5mg/ml （如植物要低）◆目标蛋白浓度：0.001mg/mlE.Coli表达例子◆E.Coli表达蛋白：10菌体/1培养基◆抽提蛋白中目标蛋白为10%◆1:4（w/v）抽提蛋白为30mg/ml◆产量为150mg/ml◆目标蛋白浓度：3mg/ml细胞培养上清的例子◆蛋白质浓度（含血清培养基）：4mg/ml ◆IgG总浓度：0.8mg/ml◆目标IgG浓度：0.03mg/ml电泳分析的样品制备原则◆电泳检测贯穿整个纯化过程◆上样缓冲液对蛋白质的溶解性要高于抽提液，否则拖尾。
第五章亲和层析分离技术详解演示文稿
第1页，共43页。
优选第五章亲和层析分离技术
第2页，共43页。
5.1 简介
利用生物大分子之间的专一性识别性或特定的相互作用的 分离技术称为亲和层析分离技术
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简介——亲和配基
单专一性的小分子配基 基团专一性小分子亲和配基 专一性的大分子亲和配基 免疫亲和配基
Procion Red MX-4R Procion Yellow MX-
4R Remazol Organe R
Cibacron Blue F3-GA
Procion Red HE3G
Remazol Blue R Procion Yellow
H-E6R
Procion Blue MXG
Procion Organge MX-2R
PL Biochemical
SIGMA
典型应用
腺苷激酶及脱氨酸
依赖辅酶A的酶
磷酸化酶
激酶 CoA转移酶， 乙酸-CoA酶 5-核苷酸酶
核酸酶 谷氨酸脱氢酶
第30页，共43页。
核苷酸及辅酶亲和层析
N6（6-氨己基）氨甲酰-AMP-Sepharose间接偶联法示意图
第31页，共43页。
核苷酸及辅酶亲和层析
第43页，共43页。
第15页，共43页。
介质的选择
专一性（Specifcity）、容量（capacity）及稳定 性（stability）是衡量所选介质好坏的三个标准
用于分析时，专一性比容量及稳定性重要，而应 用制备时，吸附剂的稳定性是最主要的指标，同时 还要考虑成本因素。对于不同的介质而言，这些要 求不可能同时满足。所以在介质的选取时，应该根 据具体的分离要求选择合适的介质。
层析分离技术图文
利用层析分离技术，如活性炭吸附、 聚合物吸附等，可去除水中的有机污 染物，提高水质，保障饮用水安全。
05
层析分离技术的未来发展与挑战
新材料与新技术的研究与应用
新型吸附剂
研究具有高选择性、高吸附容量的新型吸附剂，以提高层析分离 的选择性和效率。
新型固定相
探索具有优异性能的新型固定相，以适应不同分离需求和条件。
层析分离技术图文
• 层析分离技术概述 • 层析分离技术的分类 • 层析分离技术的操作流程 • 层析分离技术的应用实例 • 层析分离技术的未来发展与挑战
01
层析分离技术概述
定义与原理
定义
层析分离技术是一种基于不同物质在 两相中的分配系数不同而实现分离的 物理分离方法。
原理
利用流动相和固定相的相互作用，使 混合物中的各组分在固定相和流动相 之间进行吸附、脱附、溶解、挥发等 过程，从而实现各组分的分离。
上样量控制
控制上样量，确保样品在柱子上得 到有效分离。
洗脱
洗脱液选择
根据分离需求选择合适的洗脱液，如有机溶剂、缓冲液等。
洗脱方式
采用适当的洗脱方式，如分段洗脱、梯度洗脱等。
洗脱速度控制
调节洗脱速度，确保样品得到充分分离。
检测与收集
检测方式
01
根据待分离组分的性质选择合适的检测方式，如紫外可见光谱、
纳米技术
利用纳米材料和纳米技术，开发具有高分离性能的纳米尺度层析分 离材料。
提高分离效率与分辨率
优化分离条件
深入研究层析分离的原理和动力 学过程，优化分离条件，提高分 离效率和分辨率。
联用技术
将层析分离与其他分离技术联用， 实现多维分离，进一步提高分离 效果。
实验层析技术血清球蛋白的分离纯化与鉴定正式版ppt
G-75 G-100
40～120 40～120
12～15 15～20
3×103 ～ 8×104 4和个性
共性： *生命高分子：透析、超滤、超离心、凝胶层析 *蛋白质溶液是亲水胶体：稳定因素为水化膜和电荷→盐析/
有机溶剂沉淀 *两性电解质和等电点：pH> pI，蛋白质带负电；反之带正 电→电泳、离子交换层析 *有一定的功能：抗原性→ 免疫沉淀
交联葡聚糖凝胶层析介质的有关技术参数
凝胶型号 颗粒大小（μm) 溶胀体积(ml/g) 分离范围（Mr）
G-10 G-15 G-25 G-50
40～120 50～150 50～150 40～120
2～3 2.5～3.5 4～6 9～11
＜7×102 ＜1.5×103 1×103 ～5×103 1.5×103 ～ 3×104
*洗脱液：溶解待分离物质，不变性
阳离子交换剂 带负电荷，与混合物中带正电的组分结合 阳离子交换层析
交联葡聚糖凝胶
➢多聚葡萄糖与环氧丙烷交联而成，网状结构珠状颗 粒，商品名为Sephadex G系列 ➢G—交联度：G后面的阿拉伯数字表示不同的规格型 号，有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100， G-150，和G-200八种，具体含义为凝胶得水值的10 倍或吸水量（g）/10g干胶 ➢交联度与孔径大小成反比：交联度越大，孔径越小， 吸水性小；交联度越小，孔径越大，吸水性大。因此， “G”反映凝胶的交联程度，膨胀程度及分部范围。
异—吸附力、分子形状、大小、酸碱性或分子 ③浓缩：sephadex G-25吸水，利用高分子性质。
01M磷酸盐缓冲液（0. 分离依据：蛋白质理化性质的和个性
极性、分子亲和力以及分配系数。 蛋白质为两性电解质，有一定的等电点，在大于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动，由于各种蛋白质的分子大小与结构
蛋白质化学中的层析技术PPT课件
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蛋白质化学中的层析技术PPT 课件
目
CONTENCT
录
• 层析技术简介 • 层析技术在蛋白质分离纯化中的应
用 • 层析技术原理 • 层析技术的应用实例 • 层析技术的优缺点及展望
01
层析技术简介
层析技术的定义
层析技术
是一种分离和纯化混合物中各组分的方法，基于各 组分在固定相和流动相之间的分配差异进行分离。
05
层析技术的优缺点及展望
层析技术的优点
分离效果好
层析技术能够根据分子间的吸附、分配等作用力 的差异，将混合物中的组分进行有效的分离，得 到高纯度的产物。
适用范围广
层析技术可以应用于不同性质的混合物分离，如 有机物、无机物、离子、蛋白质等，具有广泛的 适用范围。
分离过程可重复
层析技术是一种物理分离方法，不涉及化学反应 ，因此分离过程可以重复进行，适用于大规模分 离和制备。
凝胶过滤层析原理
原理概述
凝胶过滤层析是一种基于分子 大小差异的分离技术。通过不 同孔径的凝胶介质，不同大小 的分子会以不同的速度通过凝 胶，从而实现分离。
应用范围
凝胶过滤层析常用于蛋白质、 多糖等大分子物质的分离和纯 化。
技术特点
操作简便、分离效果好、分辨 率高。
离子交换层析原理
01 02
原理概述
1950年代
随着凝胶技术的发展，凝胶层 析、电泳等新型层析技术逐渐 兴起。
1970年代至今
层析技术不断改进和创新，应 用范围越来越广泛，成为生物 化学领域中重要的分离分析方 法。
层析技术的分类
根据固定相和流动相的物理状态
可分为液相层析和气相层析。液相层析又可分为液-固层析和液液层析，是生物分子分离纯化中最常用的技术。
9种层析分离纯化方法详解
9种层析分离纯化方法详解层析法是利用不同物质理化性质的差异而建立起来的技术。
所有的层析系统都由两个相组成：一是固定相，它或者是固体物质或者是固定于固体物质上的成分；另一是流动相，即可以流动的物质，如水和各种溶媒。
当待分离的混合物随溶媒（流动相）通过固定相时，由于各组份的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量对比）不同，而且随溶媒向前移动，各组份不断地在两相中进行再分配。
与固定相相互作用力越弱的组份，随流动相移动时受到的阻滞作用小，向前移动的速度快。
反之，与固定相相互作用越强的组份，向前移动速度越慢。
分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组份，从而达到将各组份分离的目的。
按层析原理可将层析分为以下9种：1、亲和层析利用待分离物质和它的特异性配体间具有特异的亲和力，从而达到分离的目的。
将可亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连作为固定相吸附剂，当含混合组分的样品通过此固定相时，只有和固定相分子有特异亲和力的物质，才能被固定相吸附结合，性无关组分随流动相流出。
改变流动相组分，可将结合的亲和物洗脱下来。
亲和层析中所用的载体称为基质，与基质共价连接的化合物称配基。
具有专一亲和力的生物分子对主要有：抗原与抗体，DNA与互补DNA或RNA，酶与底物、激素与受体、维生素与特异结合蛋白、糖蛋白与植物凝集素等。
亲和层析可用于纯化生物大分子、稀释液的浓缩、不稳定蛋白质的贮藏、分离核酸等。
亲和层析纯化的分离原理特点：亲和层析具有高选择性、高纯度、快速、浓缩等特点，在重组蛋白的分离中多作为第一步的粗纯，实现对绝大部分杂质蛋白的去除。
2、离子交换层析采用具有离子交换性能的物质作固定相，利用它与流动相中的离子能进行可逆交换的性质来分离离子型化合物的方法。
主要用于分离氨基酸、多肽及蛋白质，也可用于分离核酸、核苷酸及其他带电荷的生物分子。
不同蛋白质的等电点（pI，isoelectric point）特性，使在不同pH缓冲液条件下所带正/负净电荷不同，选择不同的离子交换柱实现分离。
有机物分离与纯化的方法柱层析的一些技巧
有机物分离与纯化的方法柱层析的一些技巧柱层析是有机物分离与纯化中常用的一种方法，它适用于各种有机物分离和纯化的需求，具有操作简单、分离效果好、分离范围广等优点。
以下是柱层析的一些技巧和注意事项：1.选择合适的固定相：柱层析的关键是选择合适的固定相。
固定相应根据有机物的性质选择，例如，非极性化合物可选择疏水性固定相，而极性化合物可选择亲水性固定相。
此外，选择固定相时还需考虑其耐酸碱性、耐溶剂性以及稳定性等因素。
2.预处理样品：在进行柱层析之前，需要对样品进行预处理。
通常，样品需要经过一系列的前处理步骤，如提取、结晶、干燥等，以去除杂质和水分，确保柱层析的准确性和精确性。
3.选择合适的洗脱剂：洗脱剂的选择应根据样品的性质和分离要求进行。
通常，洗脱剂应具有良好的溶解度、流动性和洗脱效果。
此外，还应注意洗脱剂对固定相的稳定性和可逆性的影响。
4.控制流量和压力：柱层析时，通过控制流量和压力来控制洗脱速度。
一般情况下，流速应控制在适当的范围内，以避免样品在柱上停留时间过短或过长，同时还应注意防止柱内压力过高导致流动性降低。
5.分馏收集：柱层析过程中，不同组分的洗脱剂和样品溶液需要分馏收集。
对于挥发性较强的组分，可采用低温收集或短时间收集的方法，以减少组分的损失。
6.调整pH值：一些有机物分离和纯化需要在特定pH条件下进行。
在柱层析前，需要对洗脱剂或样品溶液进行调整，以改变pH值，提高分离效果。
7.重复柱层析：柱层析是一个可重复进行的操作，可以根据需要多次进行柱层析。
在重复柱层析过程中，需要逐步提高洗脱剂的极性或采用不同的洗脱剂组合，以实现更好的分离效果。
8.优化条件：在柱层析过程中，需进行条件优化。
通过调整柱层析的参数，如固定相类型、样品负载量、洗脱剂类型和流速等，以达到最佳分离效果。
9.保护柱层析柱：柱层析柱是一种易损耗的设备，应注意保护。
在使用过程中，应避免受到机械碰撞和高温等有害因素的影响，避免使用过量的洗脱剂和样品负载，以延长柱层析柱的使用寿命。
层析分离纯化技术策略共58页PPT资料
8
pH 的重要性: 蛋白质净电荷随 pH 改变
滴定曲线
3
+
pH
10
稳定性范围
不同 pH 下的分离情况
1
蛋白质净电荷
用阳离子交换
用阴离子交换
2
-
1
2
9
pH 的重要性: 蛋白质净电荷随 pH 改变
流动相的 pH 选择性
Abs
Abs
Abs
Abs
V
V
V
V
+ 阳离子
表面净电荷
0
pH
阴离子
-
Abs
Abs
Abs
3
沉淀蛋白质的方法
(1) 盐析法 (2) 有机溶剂沉淀法 (3) 重金属盐沉淀法 (4) 加热变性沉淀法
4
蛋白质纯化策略
融合蛋白质
简单纯化
一步 亲和层析 90 - 97 % 纯度
更高纯度
多步纯化
表达
非融合蛋白质
5
粗提 中度纯化 精细纯化
三步纯化策略
高效纯化策略
分辩率 精细纯化
纯化
分解目标分子
17
预防措施
膜过滤、离心、匀 浆
离心、如可跟目标 分子兼容，可用有
机溶剂
添加硫酸链霉素、 硫酸精蛋白或锰盐 沉淀核酸、添加核
酸酶
添加蛋白酶抑制剂 、用亲和层析去除 蛋白酶、缩短粗分 时间、低温操作
粗提
目的
纯化粗样 快速浓缩 (减少体积) 和稳定样品 (去除蛋白
酶) 最适用层析技术: 离子交换 / 疏水层析
Step
12
三步纯化策略
层析填料的 颗粒大小
精细纯化 中度纯化
层析分离纯化技术
内容提要
1、层析原理与操作
2、蛋白质纯化策略
生命科学与生物技术
从基因组到蛋白质
从有限到无限 离心
• 生物分离技术
沉淀 电泳
• 基因重组技术 层析
• 免疫检测技术
层析原理与操作
原理与操作
层析的起源和原理
• 起源----1906年，俄国植物学家Tsweet
• 原理----利用物质分配系数不同达到分离
软件系统
Manual Screen
DuoFLow
软件系统
DuoFLow
Browser – Enter User and Method Name
软件系统
DuoFLow
Setup –select hardware
软件系统
DuoFLow
Protocol – enter method
软件系统
Post Run Options - Activity
负电荷的氧原子（P位点） • 2 个羟基 • 于其他层析介质不同，CHT的骨架是
凝胶过滤层析
高 疏水作用
pH——中性
流速，根据层析介质的说明，一般很低 样品容量：1－3％CV
凝胶过滤层析的应用
凝胶过滤层析
• 1.可分离相对分子量从几百到几十万的物质
具有3000个理论塔板的凝胶过滤可将分子量相差2倍的蛋白 质完全分开,6000个理论塔板的可将分子量相差1.5倍的蛋白质完 全分开;建议柱高在80-120cm,直径=H/30
50um
Macro-Prep high S Macro-Prep CM
Macro-Prep 25 Q Macro-Prep 25 DEAE Macro-Prep 25 S
第五章 层析分离技术
Resolution: depends on efficiency and selectivity
27
层析分离的基本概念
色谱柱的理论塔板数N与高度H
tR 2 N 5.54( ) W1/ 2
N---理论塔板数 tR---保留时间 W1/2---半峰宽
AU280
理论塔板高度：L---柱长
Wh = Peak width at half peak height Vr
22
层析分离的基本概念
分配系数 可由Langmuir方程得出
q Kd c K ---分配系数
d
q、c---溶质在固相和液相中的浓度
23
层析分离的基本概念
滞留时间（tR）和滞留体积（VR） 反应样品在柱子中的保留或阻滞能力，是色谱 过程的基本热力学参数之一
24
层析分离的基本概念
洗脱体积 色谱柱中，使溶质从柱中流出所需流动相体积，为洗脱 体积
20
3、有机溶剂沉淀
降低水溶液的介电常数，增加蛋白质不同电荷之间 的静电引力，使蛋白质产生沉淀； 有机溶剂与水作用使蛋白质的表面水化层厚度压缩， 导致蛋白质脱水，蛋白质间的疏水作用增强，从而产生 沉淀。
21
五、层析系统的基本概念及要求
Resolution Efficiency Selectivity Symmetry
3
第一节 层析概述
一、层析的原理
层析技术是一组相关分离方法的总称，当待分离的 混合物随流动相通过固定相时，由于各组份的理化 性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、 结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量对比） 不同，而且随流动相向前移动，各组份不断地在两 相中进行再分配，从而达到将各组份分离的目的。
层析分离技术资料
利用层析分离技术，可实现环境样品中放射性物质的分离和分析，为核
工业和核医学等领域的安全监测提供支持。
06
层析分离技术的未来发展与挑战
新材料与新技术的发展趋势
高性能分离介质
随着新材料技术的发展，具有优异性能的分离介质不断涌现，如 高分子材料、纳米材料等，能够提高分离效率和分离精度。
智能化与自动化
利用人工智能、机器学习等技术，实现层析分离技术的智能化和自 动化，提高分离过程的可控性和稳定性。
创新应用领域
探索层析分离技术在生物医药、 环境治理、能源开发等领域的创 新应用，推动相关产业的发展。
解决实际应用中的挑战与问题
分离效率与分离成本的平衡
01
ห้องสมุดไป่ตู้
在提高分离效率的同时，降低分离成本，以满足实际应用的需
求。
分离过程的安全与稳定性
02
提高层析分离技术的安全性和稳定性，减少分离过程中的事故
风险。
环境样品中痕量物质的分离分析
01
污染物分析
利用高效液相色谱、气相色谱等层析分离技术，可实现环境样品中痕量
污染物的分离和分析，为环境监测和污染治理提供技术支持。
02
有毒有害物质的检测
通过层析分离技术，可分离和检测环境样品中的有毒有害物质，如重金
属、农药残留等，为环境安全和人类健康提供保障。
03
放射性物质的分离分析
原理
利用混合物中各组分在两相（固定相 和流动相）中分配系数的不同，使不 同组分在固定相上滞留时间不同，从 而实现各组分的分离。
技术发展历程
1903年
俄国植物学家茨维特发明了吸 附层析法，开创了层析分离技
术的先河。
1941年
层析分离技术
层析分离技术第六章层析分离技术第⼀节吸附⼀、吸附层析的原理与特点吸附是利⽤吸附剂对液体或⽓体中某⼀组分具有选择吸附的能⼒，使其富集在吸附剂表⾯，⽽从混合物中的分离的的过程。
典型的吸附过程包括四个步骤：固体内部分⼦所受分⼦间的作⽤⼒是对称的，⽽固体表⾯分⼦所受⼒是不对称的。
向内的⼀⾯受内部分⼦的作⽤⼒较⼤，⽽表⾯向外⼀⾯所受的作⽤⼒较⼩，因⽽当⽓体分⼦或溶液中溶质分⼦在运动过程中碰到固体表⾯时就会被吸引⽽停留在固体表⾯上。
吸附的类型（1）物理吸附: 放热，可逆，单分⼦层或多分⼦层，选择性差（2）化学吸附: 放热量⼤，单分⼦，选择性强（3）交换吸附: 吸附剂吸附后同时放出等当量的离⼦到溶液中物理吸附与化学吸附的特点吸附法特点（1）不⽤或少⽤有机溶剂（2）操作简便、安全、设备简单（3）⽣产过程pH 变化⼩（4）从稀溶液分离溶质（5）吸附剂对溶质的作⽤⼩（6）吸附平衡为⾮线性（7）选择性较差吸附法的应⽤⽓体过滤⽔处理脱⾊、除臭⽬标产物的分离⼆、吸附剂（固定相）的选择吸附剂通常应具备以下特征：表⾯积⼤、颗粒均匀、对被分离的物质具有较强的吸附能⼒有较⾼的吸附选择性机械强度⾼再⽣容易、性能稳定价格低廉。
常⽤的吸附剂有极性的和⾮极性的两种。
羟基磷灰⽯、硅胶、氧化铝等属前者，活性炭属后者⼈⼯合成的如⼤⽹格吸附剂、分⼦筛等两种都有。
但⼤多属⾮极性的常⽤的吸附剂1⼤⽹格聚合物吸附剂：2活性碳：助滤，脱⾊，去热原使⽤:偏酸性(pH 5-7),加热(50-60℃)搅拌30min活性⽩⼟：脱组胺类过敏物，脱⾊。
硅藻⼟：助滤，澄清1.⼤⽹格聚合物吸附树脂的⽹络⾻架⼤⽹格树脂吸附法Ⅰ. 基本概念⼀．什么是⼤⽹格树脂吸附法？将多孔的⼤⽹格吸附树脂作为吸附剂，利⽤表⾯分⼦与物质分⼦间范德华引⼒，把液相中物质吸附到吸附树脂表⾯。
◆⼤⽹格树脂吸附法与离⼦交换法的⽐较：相同：①操作⽅法：静态法、动态法；②⾻架结构：树脂均有溶胀孔隙和永久孔隙的⼤⽹格⾻架结构。
分离纯化策略(扬州)
1.00 10.0
0.75 4 50.0 0.50 5.0 7.5
0.25
3 2 1
2.5
0.00 0.0
0.0
UNOsphere S初纯
00:00:00 AU 00:10:00 Hr:Min:Sec 00:20:00 00:30:00 pH
工艺路线选择 2、IEX——CHT
UNOsphere S和CHT羟基磷灰石两步纯化鼠mAb IgG
AU
mS/cm
Application of CHT and High Q in purification of Recombinant proteins in yeast
许望翔 军事医学科学院放射医学研究所
Expression of the Yeast recombinant protein X
蛋白质分离纯化策略 DuoFlow中高压层析系统
沈志扬
Product Manager，Bio-Rad，China May 25，2009，扬州
蛋白质分离纯化策略 蛋白质纯化
蛋白质分离纯化策略
平台之一——生化学家分离未知蛋白
规模较小，目标蛋白含量往往极低 各步骤用活性分析和蛋白物理化学分析严密监控 针对性强，过程复杂 产物纯度要求高，往往用户测序
收集馏分的SDS -PAGE分析图。泳道1：HSA； 泳道2：α1-AT（Sigma）；泳道3：上样液；泳 道4-10：图3之收集馏分I-VII
工艺路线选择
少量蛋白质纯化和精纯：Uno Q、S离子交换层析柱
in .0m 10
10分钟内彻底分析分离4种 蛋白质，可用于小量复杂蛋 白质样品的分析和制备
Before Starting…
• 必须了解的蛋白特性