107649-生物药物分析与检验-第六章 生物检定法

• 但因为口服生物利用度低，临床上常用其针剂。 这给患者带来了诸多不便，此外长期注射还会产 生许多不良反应。
• 但目前有关胰岛素非注射给药普遍存在的问题是 (1):膜障，胰岛素分子易聚集；（2）：酶解，被
胃肠道中的蛋白水解酶降解。
许多蛋白质，如酶蛋白、激素蛋白等，它们在体内常 以无活性的前体存在，在一定情况下经体内的蛋白酶水解 ，切去部分肽段后，才变成有活性的蛋白质。
菌液的制备
加菌液
加陶瓦园盖
可靠性测验，计算结果 ←──测量抑菌圈←─培 养
二剂量法
二剂量法的原理与测定方法： 该法系将抗生素的标准及检品
各稀释成一定比例(2:1或4:1)的二种 剂量，即高剂量和低剂量。在同一 培养基平皿上进行对比，根据它们 所产生的抑菌圈大小计算检品的效 价。
二、操作方法
基本要点：
• 图中央是青霉菌，周围是致病细 菌。距青霉素最远的细菌个大、 色浓，活力十足；距青霉菌较近 的细菌个较小、色较浅，活力较 差；而最接近青霉菌的细菌个最 小、色发白，显然已经死亡
• 二战中，为了拯救战场上的大批伤员， 急需大批青霉素，美国政府甚至不惜动 用军用飞机，从世界各地采集含青霉菌 的土壤以筛选分泌青霉菌种。
（一）概述
效价测定技术方法：
1、物理、化学法：简便、快速，本身纯度不高， 采用该法会引起偏差，因此只有在纯度较高情 况下可采用
2、微生物法：原理和临床应用的要求相一致， 直接反映出抗生素的疗效，且灵敏度较高，需 用量较小，因此被广泛使用。
管碟法：是利用抗生素在含敏感试验菌 的琼脂培养基中的球面扩散渗透作用， 从而形成一定的抑菌圈。通过琼脂培 养基，可观察并测量出抑菌圈的大小。 在一定的抗生素浓度范围内，对数剂 量(浓度)与抑菌圈的表面积或直径成 正比。
标准品和供试品配成相同的浓度又得到 相同的凝固程度, 则说明两者效价相同, 以此来对比测定未知样品的效价.
• 取管径均匀、洁净干燥的小试管20 支, 分别加 入血浆0. 5 mL, 置( 37±5) ℃恒温水浴中预热5 min～10 min后, 依次每管加入一种浓度( 质量 百分浓度) 的标准品或供试品稀释液( 1 % 、0. 5 %、0. 2 %) 及氯化钙溶液( 每种浓度3 管, 各 浓度的试管支数相等) , 加入氯化钙溶液后, 立 即混匀, 并开始计算时间, 注意观察并计算各管 凝结时间. 将各管凝结时间换成对数参照生物 检定统计法( 中国药典附录XIV) 中的量反应平 行线测定法计算效价及实验误差.
法
三剂量法（3·3法）
日常使用多采用二剂量法，对于有争议结果， 必须使用三剂量法测定的结果仲裁。
来自百度文库
抗生素的效价和单位
抗生素的含量用效价和单位表示。该词有 时不加区别统称为效价单位。
效价（ｐotency）：指检品的实际单位数 与其标示量的比值。常表示为效价的百分数。 效价是从比较检品与标准品的生物活性而得。
生物检定的应用范围
• 1、药物的效价测定； • 2、体内微量生理活性物质的测定； • 3、中药质量的控制； • 4、某些有害杂质的限度检查。
第一节 胰岛素生物检定法
• 胰岛素是治疗糖尿病的特效药，其特有优势:
1、控制血糖能力最强；
2、毒副作用小，胰岛素为正常激素，无任何毒 性，不损伤肝肾。
第三节 抗生素的微生物检定法
抗生素定义—是由微生物分 泌的化合物，其稀溶液具有
抑制或杀灭细菌的能力。
• 家里使用的消毒的东西也能杀灭生命体但只能叫 消毒剂，这种消毒剂不能用在人体里面，只能用 在体外的环境消毒使用。
• 抗生素是能在人体里面使用的，毒性比较低安全 性比较高的药物。抗生素的作用就是杀灭感染我 们体内的微生物：病毒、细菌
• 青霉素的发现者是英国细菌学家弗莱明。 1928年的一天，弗莱明在他的一间简陋的 实验室里研究导致人体发热的葡萄球菌。 由于盖子没有盖好，他发觉培养细菌用的 琼脂上附了一层青霉菌。这是从楼上的一 位研究青霉菌的学者的窗口飘落进来的。 使弗莱明感到惊讶的是，在青霉菌的近旁， 葡萄球菌忽然不见了。这个偶然的发现深 深吸引了他，他设法培养这种霉菌进行多 次试验，证明青霉素可以在几小时内将葡 萄球菌全部杀死。弗莱明据此发明了葡萄 球菌的克星—青霉素。
单位（unit,u）：是衡量抗生素有效成分的 具体尺度。
抗生素效价检定管碟法操作流程:
标准品的称量 →标准品的稀释→标准品溶液 --─┐
缓冲液的制备
供试品的称量 →供试品的稀释→供试品溶液 ─┐
┌───平板的制备────┐
↓
凝固后
凝固后 ↓
底层20 ml─→菌层5ml ─→ 加小钢管
培养基的制备→
• 如果说，原子弹是第二次世界大战中 杀伤力量最强的武器，那么，青霉素 就是从这个战场拯救生命最多的药物。 难怪有人把原子弹、雷达和青霉素并 列为第二次世界大战期间的三大科学 发明。为了表彰这一造福人类的贡献， 弗莱明、钱恩、弗洛里于1945年，共 同获得诺贝尔医学和生理学奖。
抗生素的危害是 什么
使用抗生素的错误认识
• 抗菌素越贵越好。不少人认为，抗菌 素的价格越贵越好，越及时治病。要 知道药不是普通商品，“便宜没好货” 的规律不适用于药品。只要使用得当， 几分钱一片的药也能达到药到病除的 疗效。
• 随意滥用。最典型的例子就是许多人 用抗菌素治疗感冒。虽然抗菌素能抗 细菌和某些微生物，但不抗病毒，感 冒大多是病毒感染，如果随便乱用抗 菌素，只会增加其副作用，并使机体 产生耐药性。
肝素
❖体内过程：口服不吸收，常静脉滴 注给药。
❖临床应用：(1)血栓栓塞性疾病：防 止血栓形成；(2)心血管手术、心导 管、血液透析血液标本等抗凝。
❖不良反应：(1)自发性出血；(2)过敏 反应；(3)孕妇使用易致早产。
低分子量肝素
low-moleucular-weight heparins,LMWHs 1.抗凝作用及应用与肝素相似。 2.血小板减少较少。 3.安全，一般不必监测抗凝活性。 4.维持时间长，每日一次。 5.促t-PA释放，有助血栓溶解。 ❖制剂：依诺肝素enoxaparin
• 青霉素终于在1943年问世，自此，青霉 素被广泛应用，创造了一个绿色的医学 奇迹，他击败了战时最可怕的杀手—— 伤口感染。
• 1944年，青霉素因治好了英国首相丘吉 尔的肺炎而闻名于世。
• 青霉素对人类最显著的贡献是在第二次 世界大战规模最大的登陆战——诺曼底 战役中，它救治了无数迎着德军炮火登 陆而负伤的盟军士兵。
第六章 生物检定标法题
• 生物检定：利用药物对生物体（整体动 物、离体组织、微生物等）的作用以测 定其效价或生物活性的一种方法。
整体和离体测定
in vivo: 直接反映药品对生物的综合作用， 但需要动物，供试品量多，耗时长；
In vitro: 不一定能反映供试品在整体的作用， 但个体差异小，实验时间短，精密度和 灵敏度高，能在一定程度上保留药理作 用特性。
替他肝素tedelparin
• 肝素钠作为天然抗凝血物质受到世界各 国的重视. 也是我国主要的出口药物之一。
• 人们发现肝素钠不但有抗凝、抗血栓形 成和调节血脂的作用, 还具有抗炎、抗过
敏、抗病毒、抗癌等功能。
• 肝素钠效价测定采用羊血浆法 . 即将肝素 钠标准品和供试品加入柠檬酸羊血浆中, 钙化一定时间后观察两者的凝固程度, 如
2、影响抑菌圈大小的因素：
抑菌圈的半径(大小)与最小抑菌 浓度C，琼脂层厚度H，抗生素在琼 脂内扩散系数D，抗生素在小钢管中 的量M，以及抗生素的扩散时间T有 关：这些因素的改变，常会影响抑 菌圈的大小和清晰度。
3、管碟法常用的三种方法：
按设计原理不同
分:
一剂量法（标准曲线法）
管
碟
二剂量法（2·2法）
① 高剂量抗生素溶液所形成的抑菌圈直径 在20～24 mm，个别抗生素的抑菌圈可在 18～24 mm；
② 高、低剂量所形成的抑菌圈之差最好大 于2 mm，有些抗生素的差数可较小；
③ 高、低剂量之比一般用2:1，当高、低 剂量所致的抑菌圈差别较小时，可用高低 剂量之比为4:1的比率。
（二）抑菌圈的形成
1、抑菌圈： 将不锈钢小管(俗称为牛津杯)放
置在含敏感试验菌的琼脂培养基上， 将抗生素溶液注入小钢管中，抗生 素分子随溶剂向培养基内呈球面状 放射状扩散。同时将培养基置入适 宜试验菌生长的培养箱中，琼脂培 养基中的试验菌开始生长。抗生素 分子在琼脂培养基中的浓度，随离 开小钢管的距离增大而降低，离小 钢管愈远，琼脂培养基中抗生素分 子愈少，相应的抗生素浓度愈低。 当抗生素分子扩散到一定时间，在 小钢管周围形成一个能有效的抑制 试验菌生长的范围，也就是通常所 说的抑菌圈。
• 效价（potency)测定是生物检定的主要内 容，它以药理为基础，生物统计为工具， 运用特定的实验设计，利用生物体在一 定条件下比较供试品与标准品或对照品 所产生的特定反应（可测量、量化的生 理指标或生物药效或毒力）的一种定量 方法，因而被称为定量毒理学。
检定方法
• 取健康无伤、同一来源、同一性别、出生日期相近的 成年小鼠，体重相差不得超过3g，按体重随机分成4组， 每组不少于10只,逐只编号, 各组小鼠分别自皮下注入一 种浓度的标准品或供试品稀释液，每鼠0.2～0.3ml，但 各鼠的注射体积（ml）应相等。注射后40分钟，按给 药顺序分别自眼静脉丛采血，用适宜的方法，如葡萄 糖氧化酶－过氧化酶法测定血糖值。第一次给药后间 隔至少3小时,按双交叉设计，对每组的各鼠进行第二次 给药，并测定给药后40分钟的血糖值。照生物检定统 计法(附录ⅩⅣ)中量反应平行线测定双交叉设计法计算 效价及实验误差。
• 链霉素、卡那霉素可引起眩晕、耳鸣、 耳聋；
• 庆大霉素、卡那霉素、万古霉素可损 害肾脏；
• 红霉素、林可霉素、强力霉素可引起 厌食、恶心、呕吐、腹痛、腹泻等胃 肠道反应；
• 氯霉素可引起白细胞减少甚至再生障 碍性贫血。
• 链霉素、氯霉素、红霉素、先锋霉素 会抑制免疫功能，削弱机体抵抗力。
抗生素可使病菌产生耐
• 2010年版的药典已经简化了程序。 • 1、实验动物减半； • 2、取消双交叉实验。
• 注意： • 1、实验常用剂量：低剂量组使血糖降低
20%-30%，高剂量组血糖值不能低于2.8。 • 2、动物质量的选择。 • 3、环境的因素。
第二节 肝素生物检定法
❖药理作用：(1)抗凝作用，体内、体外均有 效；机制：加速抗凝血酶Ⅲ(ATⅢ)对多种 凝血因子（Ⅱ、Ⅳ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ等含丝氨 酸残基的蛋白酶）的灭活。(2)其它：降脂 作用；抗炎作用；抑制血管平滑肌增生等。
• 抗生素产生很多不良反应，这是大家
屡见不鲜的。比如小孩使用了庆大霉素、 丁胺卡那霉素出现了耳聋，以后会成为 聋哑儿童，成人使用可能会有肾脏的问 题。还有红霉素里面的四环素，大量使 用会造成肝脏的损害，小孩使用会影响 牙齿和骨骼的发育问题。
• 是药三分毒，抗生素也不例外。研究 表明，每种抗生素对人体均有不同程 度的伤害。
• 无规律服药。一些人患病后，病情较 重时能按时按量服药，一旦病情缓解， 服药便随心所欲。抗菌素的药效有赖 于其有效的血药浓度，如达不到有效 的血药浓度，不但不能彻底杀灭细菌， 反而会使细菌产生耐药性。
• 多多益善。有人认为吃抗菌素越多越 好，只要是抗菌素就能消炎，甚至把 几种抗菌素一起服用。对于确属细菌 感染的疾病，只能根据引起疾病的不 同菌种选择相应的药物。
药性！
• 抗生素使用以后微生物可以针对它产 生耐药性，是细菌保护自己的措施。 如果我们滥用抗生素，环境中存在的 这些致病微生物都是耐药的，那人体 生病感染的都是耐药菌，很难有有效 的药物治疗，最后受到损害的是我们 人类自己。
• 据统计，我国每年有8万人直接或间接 死于滥用抗生素，因此造成的肌体损 伤以及病菌耐药性更是无法估量，滥 用抗生素使我们为战胜疾病付出的代 价越来越高
前体胰岛素（84 aa）
A链（21aa ）
B链（30aa）
C链（33aa）
活性胰岛素
• 胰岛素的结构
• A链
B链
A、B链
• 研究背景
胰岛胰岛素素
•不稳定 •难吸收
• 研究背景
• 胰岛素六聚体
长期以来，胰岛素的效价采用生物测定法， 不过，2010年版药典中，胰岛素的含量采 用HPLC法，生物测定法则用于胰岛素的生 物活性检测