转基因育种面临的困难

动物转基因技术和家畜转基因育种面临的问题
学院：动物科技学院
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动物转基因技术和家畜转基因育种面临的问题
（西北农林科技大学动物科技学院，杨凌 712100）
摘要:转基因技术可以将外源基因导入家畜基因组，使其获得新的可遗传性状，为培育优良家畜品种提供了革命性途径。

DNA显微注射法和体细胞克隆法是制备转基因家畜最常用的方法。

文章简要阐述动物转基因技术并探讨家畜转基因育种面临的问题和应用前景。

关键词：转基因技术；家畜育种；问题
Animal transgenic technology and the problems of transgenic breeding in livestock (Northwest A&F University,Colledge of Animal Science and Technoledge,Yangling,
Shaanxi,712100,China )
Abstract:Transgenic technology represents a revolutionary way to produce elite livestock breeds, allowing introductionof alien gene into livestock genome.Currently, pronuclear microinjection of DNA and somatic cell nuclear transfer are twopopular methods used to make transgenic farm animals.This review described theAnimal transgenic technology and discussed on the problems and application prospect of transgenic breeding of livestock.
Key words:transgenic technology;domestic animal breeding;problems
品种改良对提高家畜生产性能有着不可替代的作用, 不断对家畜的品种进行改良一直是育种工作者努力的核心。

传统的家畜育种主要以表型选择为直接目的, 通过具有优良性状的个体进行杂交获得新的品种。

近几十年来, 建立在群体遗传学和数量遗传学发展基础之上的育种进入了育种值选种阶段,这种科学、系统的选种方法使家畜育种取得巨大的进展。

然而, 基于同种间的杂交育种方法使得品种改良空间十分有限, 生殖隔离制约了远缘杂交的可行性, 使得基因库的选择只能局限在同种动物之间。

随着现代生物技术的发展, 家畜育种进入了分子育种时代。

人们在分子水平对动物的基因进行操作已成为现实, 转基因技术打破了远缘有性杂交的束缚, 实现了不同物种生物体之间的基因交流, 从而可以最大限度的利用和创造遗传变异, 改良家畜的性状, 创造新的家畜品种。

作者简介：
*通讯作者：
1 动物转基因技术
动物转基因是利用DNA重组技术, 将目的基因插入到动物的基因组中, 以获得稳定表达目的基因的个体及后代, 或者是使特定基因失活, 抑制其在个体及其后代中表达的一种技术。

生产转基因动物的技术步骤为: 目的基因的选择、纯化与克隆, 载体的选择及重组表达载体的构建, 目的基因向原核胚、体细胞或干细胞的高效转移及鉴定, 携带目的基因胚胎的构建、培养发育与鉴定, 转基因胚胎的移植, 转基因动物获得与鉴定。

运用适当的转基因方法将携带外源基因的重组表达载体导入动物细胞、配子和胚胎, 从而使目的基因整合到动物基因组中, 是生产转基因动物的关键。

目前成功获得了转基因动物的方法主要有以下几种:
1.1 DNA 显微注射法
通过显微操作仪极细的注射针将目的基因注射到动物受精卵的原核, 然后经过胚胎移植到受体动物, 从出生的后代中筛选得到转基因动物。

1982年Palmiter等[1]将大鼠的生长激素基因和小鼠的金属硫基因(mMT)启动子融合, 采用显微注射法注入小鼠的受精卵中, 获得“超级小鼠”。

该方法是制备转基因动物较常用的方法, 重复性较好。

现在的转基因动物研究大都是在Palmiter方法的基础上改进的, 已经生产了转基因兔、绵羊、猪、牛、鱼和鸡等动物。

但由该法获得的转基因动物, 其目的基因是单位点、多拷贝地随机整合到基因组, 且整合效率较低, 需要大量的原核期受精卵和代孕母亲, 因此用该法生产转基因大家畜成本昂贵。

1.2 逆转录病毒感染法
将目的基因插入逆转录病毒载体后转染包装细胞, 获得高滴度的、具有感染性的重组病毒颗粒, 然后感染早期胚胎或精原干细胞, 获得转基因后代。

1974 年Jaenisch等[2]将SV40 DNA 注入小鼠囊胚腔,发现获得的小鼠体内有SV40 DNA 整合。

随后, 该方法成功运用于制备小鼠、大鼠、猪、牛、羊和鸡等转基因动物。

该方法操作简单, 目的基因整合效率高, 不受胚胎发育阶段影响, 是目前制备转基因家禽较有效的方法。

但逆转录病毒载体所携带的外源基因一般不超过10 kb, 获得的转基因动物多数为嵌合体。

虽然该法已成功制备转基因牛、猪和山羊等家畜, 但逆转录病毒的安全性限制了其在转基因家畜育种中的应用。

1.3 胚胎干细胞(Embryo stem cells, ESCs)法
将目的基因转染已建立的ES细胞系, 转基因阳性细胞注入囊胚腔或与桑椹胚聚合, 形成嵌合体转基因动物。

但运用此法得到纯合的转基因动物需要从生殖细胞整合有目的基因的嵌合体后代中筛选,周期较长；而且ES细胞系的建立比较困难, 目前几种家畜还没有建立稳定的ES细胞系, 限制了该法在制备转基因家畜的应用。

1.4 精子载体法
将具有受精能力的精子与外源DNA 一起孵育,然后通过体外受精或单精注射, 阳性胚胎移植后获得转基因动物, 另一方面可以将外源基因直接注入睾丸来生产转基因动物。

该法操作简便, 成本低廉,
但重复性差; 目前, 其技术体系还未完全成熟, 但它是非常有发展前途的方法之一。

它可以与体外受精、早期胚胎阳性选择和胚胎超低温保存相结合,使转基因技术更加实用化、简单化。

1.5 精原干细胞(Spermatogonial stem cells, SSCs)法
分离精原干细胞, 将目的基因导入SSCs 并筛选,通过移植转基因SSCs到适龄的雄性受体动物睾丸中使之产生携带目的基因的精子, 通过自然交配或体外受精的方式产生转基因后代; 还可以将异种动物的SSCs移植到受体动物睾丸中产生异种精子。

该法具有精子载体法的优点, 并且更加稳定效率更高,可用于大规模制备转基因动物, 近来成为动物转基因研究的一个热点。

运用该法已成功制备转基因小鼠[3]以及异种移植SSCs产生的转基因大鼠[4]等动物,目前在山羊和猪两种家畜的转基因研究中取得较大的进展[5], 显示了该法在家畜转基因育种的运用潜力。

但该法需要分离SSCs并进行体外操作, 技术难度较大, 整个体系需要进一步完善。

1.6 体细胞克隆法
将目的基因导入体细胞, 通过体细胞核移植生产转基因克隆动物。

英国PPL公司与罗斯林研究所Wilmut等[6]合作, 采用该技术获得世界首例表达的人凝血因子Ⅸ(用于治疗血友病)的转基因绵羊, 乳中表达量高达125 μg/mL。

该方法总效率高于显微注射; 与基因打靶相结合, 可以产生基因组定点修饰的转基因动物; 将阳性细胞核移植后理论上可以得到100%的转基因动物, 大大减少代孕母畜的数量,适用于转基因大家畜的制备。

2家畜转基因育种面临的问题
目前, 转基因技术在家畜育种中的应用研究还处于起步阶段, 实现商业化的道路还很长, 主要的原因有以下几点:
2.1 基因功能及机理研究
迄今为止, 我们对家畜基因组的结构、功能、表达调控的机制知之甚少, 并且控制家畜重要经济性状座位大多是数量性状座位,这些座位调控性状的方式十分复杂。

目前的转基因研究主要是对少数基因进行遗传操作, 并且获得的转基因动物多是采用随机插入的方法, 一方面会影响动物自身基因的正常表达, 导致转基因动物出现各种类型的发育异常; 另一方面, 目的基因在转基因动物体内的行为很难控制, 出现目的基因的表达扰乱动物的生理平衡,或者目的基因在自身或后代中表达不稳定等问题。

2.2转基因家畜生产效率与成本
转基因家畜生产效率较低, 如牛0.7%、猪0.9%、绵羊0.9%、兔1.5%。

另外, 转基因最常用的方法是原核注射, 一方面需要昂贵的设备和熟练的技术人员, 另一方面只有约10%转基因后代的能正确高效地表达目的基因, 需要相对较多的代孕受体, 因此成功得到一头转基因动物需要较高的成本。

将体细胞在体外进行基因打靶, 可以定点插入目的基因,筛选得到目的基因正确插入的阳性细胞, 核移植后得到的转基因胚胎移植代孕母畜, 理论上得到的后代100%携带目的基因, 大大减少所需代孕母畜的生产
成本。

但目前核移植技术本身也存在诸多问题,成功率大多在5%～10%之间, 因此生产转基因克隆家畜耗费巨大。

2.3 生物安全
转基因产品的安全问题是其进入产业化阶段的最大障碍之一。

转基因动物本身是否会存在健康和福利问题; 转基因产品是否会对人体健康产生危害；转基因生物是否会对自然界产生基因污染, 破坏生态平衡, 这一系列的问题都还需要充分的证据来解答。

2.3.1 转基因家畜与健康
由于外源基因的插入, 转基因家畜的某些内源基因可能会被破坏或正常表达受到影响, 引起转基因家畜非目标性状的改变, 轻则影响其生产性能,重则影响正常生长发育。

Rejduch等[7]对携带牛生长激素的转基因猪的配子发育和繁殖性能研究, 结果发现转基因猪交配欲望弱、成功率低、窝产活仔数平均少 3 头。

另外, 目的基因在转基因动物体内的过度表达也会破坏正常的内稳态, 从而引起其他生理状态的改变。

牛奶中重组人血清白蛋白表达水平在40 g/L 以上的转基因牛, 其产奶期缩短了, 而表达水平在1～2 g/L 的转基因牛则产奶期相对正常[8]。

2.3.2转基因家畜与食品安全
转基因家畜产品的安全性是阻碍其进入市场的最重要问题, 目前还没有研究报告显示转基因食品确切的危害性。

Appel等[9]将转基因牛生产的人重组乳铁蛋白饲喂小鼠, 连续饲喂13 周后对小鼠进行临床及行为学观察、生理生化指标检测、全身和不同组织器官的显微检测, 结果显示, 实验组小鼠没有出现明显的不良临床反应。

2.3.3 转基因家畜与环境
转基因生物可能会和野生型或其他物种杂交发生转基因漂移, 危及生态。

由于转基因家畜的饲养管理方式, 其对环境产生的威胁远低于转基因植物、微生物和鱼等生物。

但转基因家畜可以通过与野生型家畜发生遗传交流来扩散外源基因; 另一方面, 转基因家畜的排泄物可能含有转基因产物, 对环境以及人产生潜在的威胁。

Wheeler等[10]对携带牛α-乳清蛋白的转基因猪进行环境风险评估, 对与转基因猪同圈饲养的非转基因猪、与转基因雄性猪交配2天或7天的雌性非转基因猪的多种器官和组织进行PCR 检测, 没有发现外源基因的存在。

3展望
目前各国都加大了对动物基因组计划的投入,许多控制家畜重要经济性状的遗传机制也将逐渐被揭示, 这将为转基因技术在家畜品种改良的应用提供更坚实的理论基础。

基因打靶技术, 克隆技术的逐步改进以及新型转基因技术的出现也将大大提高转基因效率, 促进转基因育种的发展进程。

总之, 随着21 世纪生物技术的快速发展, 转基因技术将会在家畜育种领域发挥无可替代的作用。

参考文献：
[1] Palmiter RD, Brinster RL, Hammer RE, TrumbauerME,Rosenfeld MG, Birnberg NC, Evans RM. Dramatic growthof mice that develop from eggs microinjected with metallothionein-growth hormone fusion genes. Nature, 1982,300(5893): 611–615.
[2] Jaenisch R. Infection of mouse blastocysts with SV40DNA: Normal development of the infected embryos andpersistence of SV40-specific DNA sequences in the adultanimals. Cold Spring HarbSymp Quant Biol, 1974, 39(1):375–380.
[3] Nagano M, Brinster CJ, Orwig KE, Ryu BY, AvarbockMR, BrinsterRL.Transgenic mice produced by retroviraltransduction of male germ-line stem cells. ProcNatlAcadSci USA, 2001, 98 (23): 13090–13095. [4] Kanatsu-Shinohara M, Kato M, Takehashi M, Morimoto H,Takashima S, Chuma S, Nakatsuji N, Hirabayashi M, ShinoharaT. Production of transgenic rats via lentiviraltransductionand xenogeneic transplantation of spermatogonialstemcells.BiolReprod, 2008, 79(6): 1121–1128.
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