蛋白质组学在植物逆境中的研究进展

生物制药与研究

2019·02

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Chenmical Intermediate

当代化工研究

蛋白质组学在植物逆境中的研究进展

＊黄浩然

（南京师范大学附属扬子中学 江苏 210048）

摘要：蛋白质组学作为一个新兴研究领域，在推动生物研究从基因到蛋白质，从序列到功能的发展上起巨大作用。本文总结蛋白质组学

的研究方法以及植物在多种逆境下性状变化背后的蛋白质组成、特异表达和功能差异，为获得良好逆境适应性状提出一些可行的研究方法。关键词：植物逆境；蛋白质组学；研究方法

中图分类号：R 文献标识码：A

Research Progress of Proteomics in Plant Adversity

Huang Haoran

(The Affiliated Yangzi High School of Nanjing Normal University, Jiangsu, 210048)

Abstract ：As an emerging research field, proteomics plays a huge role in promoting biological research from genes to proteins and from

sequence to function. This paper summarizes the proteomics research methods and the differences in protein composition, specific expression and function of plants under various adverse conditions ，and proposes some feasible research methods for obtaining good adaptability traits.

Key words ：plant stress ；proteomics ；research methods

前言

功能基因组时代是指人类基因图谱绘制完成后对基因功能的探究。随着人类基因组计划的完成，许多植物的基因组也被测序完成，生物学界对基因的研究已进入了对基因功能的探索阶段。基因决定生物体的潜在表型，但是蛋白质的不同组成，蛋白质与蛋白质之间的互作以及蛋白质与周围环境的互作，导致植物个体间的最终表型不尽相同。因此，本文侧重于对基因功能执行体—蛋白质的研究，通过阅读文献了解植物蛋白质组学在探索植物抗逆的作用。

1.蛋白质组学的概念和研究方法

(1)蛋白质组学的概念

蛋白质组学以蛋白质组为研究对象，通过分析蛋白质的组成、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的互作与联系，在整体水平上研究蛋白质调控生命活动的规律，从功能的层次上探索生命活动的规律和解释未知生命现象，它对探索已知基因的表达模式以及在探明植物抗逆境方面有着突出的贡献。

(2)蛋白质组学研究方法

之前对于蛋白质组的研究方法主要是通过不同的抗体去寻找混合物中的蛋白质，这种方法不仅成本高而且耗时长，极大地限制了蛋白质组学的发展。

①蛋白质双向电泳

蛋白质双向电泳技术（two-dimensional electropho- resis，2-DE）是根据蛋白质等电点的不同先进行第一向的等电聚焦电泳；之后再转移到SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，根据相对分子量大小不同进行分离。蛋白质具有不同等电点，所以可以通过设置不同的pH梯度使蛋白质根据等电点的不同聚集在不同pH下，从而完成第一向分离；另外，SDS可以使蛋白质根据分子量的不同带上不同量电荷，这样蛋白质就可以根据分子量不同分离出来。通过这两种电泳技术的结合使得蛋白质在二维图上形成数千个点，可大通量的将蛋白质分离出来进行鉴定。

②蛋白质质谱

随着质谱技术的发展，科学家开始将质谱技术应用于蛋白质分析，原理是利用每种蛋白质或多肽的质荷比不同在质谱仪中会有不同的运动时间，从而对这些蛋白质或多肽进行数据采集分析。蛋白质质谱方法可分两类，第一类是用稳定同位素标记的定量蛋白质组学，比如iTRAQ和TMT；第二类是非标记定量技术，比如label-free。一般来说，iTRAQ 的方法更加准确，但是对于样本有较强限制，适用于小样本；label-free技术虽然一次可检测较多样本，但是这种技术的重现率会较低。

(3)蛋白质组学的实验步骤

①蛋白质的沉淀

盐析法利用盐离子电离可以破坏蛋白质水合层的原理，由于各种蛋白质盐析所需盐浓度和pH不同，则加入不同浓度的盐即可选择性沉淀蛋白质，一般常用硫酸盐和磷酸盐等使蛋白质沉淀析出。有机溶剂沉淀法采用有机溶剂，通过降低溶液电离常数，增强中性离子间静电引力，破坏水合层，从而使蛋白质聚沉析出。下面通过表格对比这些沉淀方法。

优点

缺点

盐析法成本低，Pr不易变性，操作简便，价格低，试剂数量少纯化倍数低，分辨力差，缓冲能力差，pH难以控制等电点沉淀法成本低，Pr不易变性，简

便，价格低一般含有其他蛋白质杂质,须进一步分离提纯，

分辨力较差有机溶剂沉淀法有机溶剂种类多，可以选择合适的有机溶剂进行实验试剂较贵且有毒。操作麻烦，溶剂一般流动性较差

致沉淀速度慢选择性沉淀法

其他蛋白质变性沉淀而不使

目标蛋白质变性

对于分离不耐高温、酸碱

的蛋白质效果差

表1 各种蛋白质沉淀的方法

Table 1. Methods for protein precipitation ②蛋白质分离

离心技术利用旋转产生的巨大离心力，将处在离心机中

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溶液中的悬浮颗粒漂浮或沉降，从而将蛋白质分离出来。层析技术是利用不同物质的理化性质在固定相和流动相不同的分配系数，从而使物质在两相间多次分配以分离物质，凝胶过滤层析可通过分子直径大小进行分离；离子交换层析可以通过电荷量大小的差别进行洗脱分离；亲和层析可通过专一分子和配基可逆结合的特性进行分离；高效液相层析法，可对不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂分离后，直接进入检测器分析。

优点

缺点

凝胶过滤层析

操作条件温和，温度范围广，能保持分离成分的理化性质，高分子物质分离效果好分辨率低，分离较慢离子交换层析吸附容量大，亲水性较好，对大分子吸附不非常紧密，蛋白质不会变性，回收率高等电点接近的杂蛋白分离效果较差，结构特殊的蛋白质结合离子交换

层析较难亲和层析可对天然大分子物质进行高特异性的分离纯化，亲和力较好机械强度低，载体较昂贵，配基制备较困难高效液相层析

应用范围广，流动相种类多，分离效率高，选择性好，检测灵敏度高，操作自动化

分析成本高，价格及日常维护费用贵，分析时

间较长

表2 各种层析技术的对比

Table parison of various chromotography

techniques

2.蛋白质组学在植物逆境研究的应用

(1)植物在盐胁迫下的蛋白质表达差异

近年来次生盐碱地面积扩大，对耐盐碱植物的需求量日益提高。植物在适应盐胁迫过程中，逐渐进化出Na +区室化、积累渗透保护物质等调控方式和代谢机制。运用蛋白质组学研究野生型和耐盐碱型之间蛋白质表达种类及含量差异，对研究栽培植物的耐盐能力、筛选耐盐植物具有显著生态和经济作用。

植物对盐胁迫的感知主要靠蛋白激酶的传递，例如在外界高盐的状况下，植物根细胞壁与原生质体发生刚性分离，这种机械运动式的分离会被机械感应器识别并转化为化学信号，通过MAP级联途径，激活P44MMK4激酶再向下传递，引起离子水平变化，受体蛋白激酶等也有类似的作用。

红海榄植物和枣树抗盐性的蛋白组学分析发现参与异戊二烯合成的蛋白质表达量上调，基本代谢有关的蛋白质表达量下调。过多的盐离子会造成植物体离子失衡，但是部分植物体可通过上调对液泡型H +-ATP酶或Na +/H +转运蛋白等膜转运蛋白的表达量将过多的盐离子束缚于液泡或者排出细胞。对玉米叶的双向电泳分析结果反映应激反应蛋白和类囊体腔19KDa蛋白的表达量均有明显下调。果树盐胁迫实验的探讨中也阐述了相似结论，以及Cl -等离子水平的上升导致植株的毒害作用。因此在盐胁迫环境下，植物体的正常生命活动将遭到严重干扰，对植物的影响主要是降低光合作用水平，部分离子的毒害作用和植物体生长调节能力下降，进而导致植物体的代谢紊乱。

(2)植物在干旱胁迫下蛋白质表达差异

近年来，由于荒漠化逐年趋于严重，对抗旱植物的需求量日益增加。干旱对植物体直接的影响是水分的缺乏导致气孔关闭，降低蒸腾作用，阻碍根部水分和无机盐的向上

运输；干旱伴随的强光照往往对叶绿素有一定程度的损害作用；水分平衡遭到破坏，叶片失绿；细胞生长减慢；促进代谢蛋白质合成量下降；抗坏血酸过氧化物酶和过氧化氢酶表达量下降导致过氧化氢的积累等。对白芥的研究表明，在重度干旱下，叶绿素a-b结合蛋白等补光复合蛋白水平的下降对叶绿体捕光和光系统功能严重损害，伴随含水量的降低，从而导致光合作用速率下降。

植物的抗旱性状的表现主要为细胞内海藻糖的积累，改变参与光合作用的部分酶的构象，上调具有热稳定或保护作用的蛋白表达量，改变应激和信号传导基因的表达量，加固细胞壁，抑制有机物代谢，保护机体蛋白质不受破坏等。与盐胁迫不同的是，植物体在面对轻度干旱胁迫时，拥有一套较完备的光合作用酶和易热变性蛋白保护机制，主要表现为：PSI与PSII外周蛋白表达量上调，维持光系统活性；在调控下，Rubisco酶表达量先降后升、马铃薯叶片中Rubisco 活化酶表达量上调，具有对Rubisco酶活性位点的羧化以保护的作用；蛋白激酶、酶、分子伴侣等参与了植物抗旱过程和关键蛋白质的保护和表达，维持并延长植物在干旱条件下的生存状况和时间，已形成较为完整的调控体系。

(3)植物在低温胁迫下蛋白质表达差异

植物耐寒性状主要由基因控制，但是冷驯化等方法可以让部分植物产生冷激蛋白，提高抗寒能力。因此对植物在冷胁迫下蛋白质表达差异的蛋白组学分析具有重要的经济意义。

冷胁迫对植株的主要影响是质膜蛋白受损，膨压下降，脂肪酸排列变化，膜产生龟裂导致细胞选择透性下降。再加上细胞代谢酶在低温下活性抑制，甚至发生酶构象改变等使酶失活，从而影响植物的正常生理活动。大量活性氧的产生与ROS活性下降导致细胞中过氧化物大量积累，最终使植物体致死。在感知并传递冷胁迫信号时MAPK级联系统依然发挥作用。研究表明，拟南芥，苜蓿对冷胁迫的反应中涉及MAPK 级联系统。在拟南芥中，CBL蛋白也能够对冷信号通过Ca 2+-ATPase和Ca/H逆向运输进行感知和传导。植物抗冷胁迫的主要途径为上调细胞内原有蛋白质表达或者表达一些具有抗冷性状的蛋白质，增加可溶性物质在细胞液中含量，在膜上增加凝固点低的油脂等方式。玉米叶和棉花子叶在低温胁迫下蛋白组学分析都表明，低温处理后植物体表达了一些低分子量的酸性蛋白，pH集中在4～7，大部分蛋白质在面对冷胁迫时表达量变化，但不发生结构变化。菊花的抗低温胁迫实验中，遗传物质相近的两组菊花表达出不同的抗寒蛋白，抗寒性状也不相同。这说明抗寒蛋白的种类对于植株抗寒性状起到较为明显的作用。同时，油酸等不饱和油脂含量的上升，膜蛋白与膜脂作用的变化，有助于植物维持膜功能。

3.总结与展望

植物的传统抗盐方式是生根减少，改变离子含量，降低光合作用等方式。这些方法有利于植物在短期较易生存，但若是在盐碱地改良等需要植物长期适应同时又要保证高产量时就不适用了。若通过对其他耐盐植物同工蛋白质的提纯与结构分析，找到已知参与植物耐盐胁迫调控的蛋白质中存在的保守氨基酸序列，运用蛋白质工程原理设计氨基酸序列，将对应的基因序列导入植物体中使之表达新的耐盐蛋白，利用组培技术大量生产，成本低效益高，或许是解决这一问题的突破口。