出血性疾病的实验室检测
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出血性疾病的实验室诊断
止血过程
Neural
BV Injury
Tissue Factor
Blood Vessel
Constriction
Reduced Blood flow
Platelet
Activation Primary hemostatic plug
Plt-Fusion
Coagulation
Activation
• 血友病A血浆 • 免疫吸附制备 • VWF含量正常
发色底物测定原理
发色底物测定原理
发色底物法分类
•直接一步测定
•FXa + Substrate Peptide + pNa (measured 405nm)
•直接两步测定 (Chromogenic FVIII)
•FX + FIXa/Ca2/PL+FVIIIa FXa +Substrate Peptide + pNa
One-Stage Factor VIII Bioassay
非平行
T
标本已被激活或技 术错误
S
50% 100%
Factor VIII Concentration (Log )
One-stage Factor VIII Assay
试剂因素：
– 磷脂 – 激活剂
因子缺陷敏感的APTT试剂
– 乏FVIII血浆
90” 90” 90”
C -- test+normal (incubated) 35” 70” 70”
D -- test+normal (non-incubated) 35” 48” 70”
Example 1 – 因子缺乏 Example 2 – FVIII抑制物 Example 3 – 即刻反应抑制物
•间接测定 (AT activity assay)
•（AT Heparin） + IIaresidual IIa + Substrate Peptide + pNa
AT活性测定
发色底物法测定F VIII:C
• 商品化试剂盒 • 两步法的原理 • SSC ISTH推荐为高纯度FVIII:C测定参比方法 • 凝固法和发色底物法哪个更优越？
狼疮抗凝物质(LA)
抗磷脂抗体
• 与抗心磷脂抗体阳性相比，狼疮抗凝物质阳性与血栓、流 产、SLE血栓具有更好的相关性
• β2GP1是血栓发生的独立的危险因素 • 抗磷脂抗体综合征分类：
狼疮抗凝物质(LA)检测
• 临床疑似APS • APTT延长 • 混合试验证实有抑制物存在 • 排除肝素导致的APTT延长
dRVVT结果分析
血管性血友病（VWD）
VWD诊断
• FVIII:C • VWF:Ag • VWF:RCo • BT • PFA-100® • VWF多聚体检测 • 胶原结合试验 • FVIII结合试验
抑制物检测方法
• Bethesda法 • Nijmegen modification
狼疮抗凝物质检测
相关概念
aCL aPL β2GP1 LA
抗心磷脂抗体 抗磷脂抗体 Β2-糖蛋白1
ELISA法检测抗心磷脂的抗体 抗体依赖或不依赖β2GP1
IgG，IgM或IgA抗体，靶蛋白是心磷脂、 β2GP1或凝血酶原，靶蛋白与磷脂结合
• PT延长＞3′， APTT延长＞5′ • 患者血浆：正常人血浆 1：1或4：1 • 即刻检测，37°C孵育2h后检测 • 结果判断： ＞X+2SD 不纠正
Mixing test 结果判断
因子缺陷
• APTT参考范围 26-34s
• APTT 60s • APTT1:1mix 32s
• APTT被纠正 • 因子缺陷
待检标本至少2个稀释倍数
Log Dose
One-Stage Factor VIII Bioassay
T S
25% 100%
Factor VIII Concentration (Log )
One-Stage Factor VIII Bioassay
非平行，交于一点
T
抑制物存在
S
50% 100%
Factor VIII Concentration (Log )
TT RT
检测方法
• ELISA法检测：
抗心磷脂抗体 抗磷脂抗体 β2GPI 抗凝血酶原抗体
• 功能测定-凝固为基础的检测
用狼疮抗凝物质检测β2GPI-磷脂和/或凝血酶原-磷脂复合物 基于PT、APTT、dRVVT 的测定
dRVVT试剂：RVV、稀释的磷脂、肝素中和剂 筛选试验：低浓度磷脂 确诊试验：高浓度磷脂
凝血因子缺陷症检测
凝血因子活性和抗原检测
• 活性测定 凝固点法
一步法 （One-Stage）---临床测定参比方法 两步法（Two-Stage）
发色底物法 （Chromogenic Factor VIII Assay） • 抗原测定
ELISA
一步法检测FVIII:C (One-Stage)
原理：
抑制物
• APTT参考范围 26-34s
• APTT 60s • APTT1:1 mix 40s
• APTT不被纠正 • 抑制物存在
Mixing test 结果解释
aPTT results
Example
123
A -- normal plasma
30” 30” 30”
B -- test plasma
• 基于 APTT凝固法 • 乏FVIII血浆倍比稀释参比血浆和待检血浆 • APTT时间与FVIII:C对数成线性关系 • 制备标准曲线
FVIII:C检测
一步法检测FVIII:C (One-Stage)
质量控制
• 标准曲线和待检标本分析前准备条件必须在相同 • 标准曲线检测FVIII:C范围尽可能宽 • 稀释倍数: 标准曲线至少3个稀释度
Thromibn, Fibrin
Stable Hemostatic Plug
出血性疾病的诊断流程
凝血途径
Fg，TT
血友病筛选及诊断试验
筛选试验
• PT • APTT • TT • Fg
确诊试验
纠正
混合试验
凝血因子活性检测 病理性抗凝物质检测
不纠正 FVBaidu NhomakorabeaII抑制物
类肝素
狼疮抗凝物质
混合试验(mixing test)
抗心磷脂抗体与心磷脂结合的桥梁蛋白
狼疮抗凝物质 功能检测，抗β2GP1或凝血酶原抗体，使凝 血时间延长
狼疮抗凝物质（LA)
• 矛盾
体内与血栓相关 体外具有抗凝活性
• 抗体抑制蛋白磷脂复合物
β2GP1 -FXI-血小板膜磷脂复合物
凝血酶原-FXa-FVa-血小板膜磷脂复合物
• 干扰磷脂依赖的凝血反应：APTT、PT及dRVVT
止血过程
Neural
BV Injury
Tissue Factor
Blood Vessel
Constriction
Reduced Blood flow
Platelet
Activation Primary hemostatic plug
Plt-Fusion
Coagulation
Activation
• 血友病A血浆 • 免疫吸附制备 • VWF含量正常
发色底物测定原理
发色底物测定原理
发色底物法分类
•直接一步测定
•FXa + Substrate Peptide + pNa (measured 405nm)
•直接两步测定 (Chromogenic FVIII)
•FX + FIXa/Ca2/PL+FVIIIa FXa +Substrate Peptide + pNa
One-Stage Factor VIII Bioassay
非平行
T
标本已被激活或技 术错误
S
50% 100%
Factor VIII Concentration (Log )
One-stage Factor VIII Assay
试剂因素：
– 磷脂 – 激活剂
因子缺陷敏感的APTT试剂
– 乏FVIII血浆
90” 90” 90”
C -- test+normal (incubated) 35” 70” 70”
D -- test+normal (non-incubated) 35” 48” 70”
Example 1 – 因子缺乏 Example 2 – FVIII抑制物 Example 3 – 即刻反应抑制物
•间接测定 (AT activity assay)
•（AT Heparin） + IIaresidual IIa + Substrate Peptide + pNa
AT活性测定
发色底物法测定F VIII:C
• 商品化试剂盒 • 两步法的原理 • SSC ISTH推荐为高纯度FVIII:C测定参比方法 • 凝固法和发色底物法哪个更优越？
狼疮抗凝物质(LA)
抗磷脂抗体
• 与抗心磷脂抗体阳性相比，狼疮抗凝物质阳性与血栓、流 产、SLE血栓具有更好的相关性
• β2GP1是血栓发生的独立的危险因素 • 抗磷脂抗体综合征分类：
狼疮抗凝物质(LA)检测
• 临床疑似APS • APTT延长 • 混合试验证实有抑制物存在 • 排除肝素导致的APTT延长
dRVVT结果分析
血管性血友病（VWD）
VWD诊断
• FVIII:C • VWF:Ag • VWF:RCo • BT • PFA-100® • VWF多聚体检测 • 胶原结合试验 • FVIII结合试验
抑制物检测方法
• Bethesda法 • Nijmegen modification
狼疮抗凝物质检测
相关概念
aCL aPL β2GP1 LA
抗心磷脂抗体 抗磷脂抗体 Β2-糖蛋白1
ELISA法检测抗心磷脂的抗体 抗体依赖或不依赖β2GP1
IgG，IgM或IgA抗体，靶蛋白是心磷脂、 β2GP1或凝血酶原，靶蛋白与磷脂结合
• PT延长＞3′， APTT延长＞5′ • 患者血浆：正常人血浆 1：1或4：1 • 即刻检测，37°C孵育2h后检测 • 结果判断： ＞X+2SD 不纠正
Mixing test 结果判断
因子缺陷
• APTT参考范围 26-34s
• APTT 60s • APTT1:1mix 32s
• APTT被纠正 • 因子缺陷
待检标本至少2个稀释倍数
Log Dose
One-Stage Factor VIII Bioassay
T S
25% 100%
Factor VIII Concentration (Log )
One-Stage Factor VIII Bioassay
非平行，交于一点
T
抑制物存在
S
50% 100%
Factor VIII Concentration (Log )
TT RT
检测方法
• ELISA法检测：
抗心磷脂抗体 抗磷脂抗体 β2GPI 抗凝血酶原抗体
• 功能测定-凝固为基础的检测
用狼疮抗凝物质检测β2GPI-磷脂和/或凝血酶原-磷脂复合物 基于PT、APTT、dRVVT 的测定
dRVVT试剂：RVV、稀释的磷脂、肝素中和剂 筛选试验：低浓度磷脂 确诊试验：高浓度磷脂
凝血因子缺陷症检测
凝血因子活性和抗原检测
• 活性测定 凝固点法
一步法 （One-Stage）---临床测定参比方法 两步法（Two-Stage）
发色底物法 （Chromogenic Factor VIII Assay） • 抗原测定
ELISA
一步法检测FVIII:C (One-Stage)
原理：
抑制物
• APTT参考范围 26-34s
• APTT 60s • APTT1:1 mix 40s
• APTT不被纠正 • 抑制物存在
Mixing test 结果解释
aPTT results
Example
123
A -- normal plasma
30” 30” 30”
B -- test plasma
• 基于 APTT凝固法 • 乏FVIII血浆倍比稀释参比血浆和待检血浆 • APTT时间与FVIII:C对数成线性关系 • 制备标准曲线
FVIII:C检测
一步法检测FVIII:C (One-Stage)
质量控制
• 标准曲线和待检标本分析前准备条件必须在相同 • 标准曲线检测FVIII:C范围尽可能宽 • 稀释倍数: 标准曲线至少3个稀释度
Thromibn, Fibrin
Stable Hemostatic Plug
出血性疾病的诊断流程
凝血途径
Fg，TT
血友病筛选及诊断试验
筛选试验
• PT • APTT • TT • Fg
确诊试验
纠正
混合试验
凝血因子活性检测 病理性抗凝物质检测
不纠正 FVBaidu NhomakorabeaII抑制物
类肝素
狼疮抗凝物质
混合试验(mixing test)
抗心磷脂抗体与心磷脂结合的桥梁蛋白
狼疮抗凝物质 功能检测，抗β2GP1或凝血酶原抗体，使凝 血时间延长
狼疮抗凝物质（LA)
• 矛盾
体内与血栓相关 体外具有抗凝活性
• 抗体抑制蛋白磷脂复合物
β2GP1 -FXI-血小板膜磷脂复合物
凝血酶原-FXa-FVa-血小板膜磷脂复合物
• 干扰磷脂依赖的凝血反应：APTT、PT及dRVVT