《酶工程实验》word版
酶工程实验
实验一淀粉酶的提取及活力测定一、实验目的淀粉酶几乎存在于所有植物中，其中以禾谷类种子的淀粉酶活性较强。
水稻萌发时淀粉酶活性最强。
水稻萌发时淀粉活性的大小与种子萌发力有关。
本实验通过对水稻萌发期淀粉酶活性测定，学习和掌握淀粉酶的测定方法，了解水稻生长与之代谢的关系。
二、原理淀粉酶能将淀粉水解成麦芽糖，由于麦芽糖能将3，5-二硝基水杨酸试剂还原成3-氨基-5-硝基水杨酸的橙红色化合物，且在一定范围内还原糖的浓度与反应液的颜色成正比，故利用比色法可求出麦芽糖的含量。
以5分钟内每克样品水解产生麦芽糖的毫克数表示酶活性的大小。
植物淀粉酶可分为α-淀粉酶和β-淀粉酶两种，其中β-淀粉酶不耐热，在温度70℃以上易钝化：而α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下则发生钝化。
根据以上特性，可分别测定这两种淀粉酶的活性。
如测定α-淀粉酶和β-淀粉酶的活性，即为淀粉酶总活性。
三、实验材料、仪器及试剂1．仪器：20ml具塞试管移液管 100ml容量瓶石英砂研钵721型分光光度计离心机恒温水箱离心管2．试剂：（1）1%淀粉溶液：称1.0克可溶性淀粉，加入100ml蒸馏水煮沸。
（临用时配制）（2）pH5.6柠檬酸缓冲液：A、称取柠檬酸21.0克，溶解后定容至1000ml；B、称取柠檬酸钠29.4克，溶解后定容至1000ml；量取A液55ml与B液145ml混匀，即为pH5.6的缓冲液。
（3）0.4mol/L氢氧化钠溶液。
（4）3,5-二硝基水杨酸试剂：取1.0克3,5-二硝基水杨酸，溶于20ml 2mol/L氢氧化钠中，加入50ml蒸馏水，再加入30克酒石酸钾钠，待溶解后，用蒸馏水稀释至100ml，盖紧瓶盖，勿使二氧化碳进入。
（5）麦芽糖标准溶液：称取0.1000克麦芽糖，溶于少量蒸馏水中，然后定容至100ml，取为1mg/ml麦芽糖标准液。
实验材料：萌发水稻种子。
四、实验方法1．酶液的制备：称取去根萌发水稻种子2克（含外壳），置研钵中，加1克石英沙研磨成匀浆。
(完整word版)酶工程
名词解释1。
酶工程：又叫酶技术，是酶制剂的大规模生产和应用的技术。
2。
自杀性底物:底物经过酶的催化后其潜在的反应基团暴露,再作用于酶而成为酶的不可逆抑制剂,这种底物叫自杀性底物?？3.别构酶;调节物与酶分子的调节中心结合后,引起酶分子的构象发生变化,从而改变催化中心对底物的亲和力，这种影响被称为别构效应，具有别构效应的酶叫别构酶4。
诱导酶:有些酶在通常的情况下不合成或很少合成，当加入诱导物后就会大量合成,这样的酶叫诱导酶5。
Mol 催化活性:表示在单位时间内,酶分子中每个活性中心转换的分子数目6。
离子交换层析9比活力11葡萄糖效应13产酶动力学15双向凝胶电泳20固定化细胞21酶化学修饰1．酶的转换数:酶的转换数Kp.又称为摩尔催化活性,是指每个酶分子每分钟催化底物转化的分子数.2．酶的催化周期:酶进行一次催化所用的时间。
3．固定化酶的比活力：指每克干固定化酶所具有的6活力单位数，它是酶制剂纯度的一个指标。
4．抗体酶：又称催化行抗体。
是一类具有生物催化功能的抗体分子。
抗体是由抗原诱导产生的抗原特异结构免疫球蛋白,要使机体具有生物催化功能，只要在抗体的可变区赋予酶的催化特性，以及酶的高效催化能力。
是通过人工设计采用现代生物技术而获得的一类新的生物催化剂，有些是自然界原本不存在的。
5．端粒酶：是一种核酸核蛋白，包含蛋白质和RNA两种基本成分.其RNA组分包含有构建端粒的重复序列的核苷酸摸板序列,在合成端粒的过程中，端粒酶以其本身的RNA组分为摸板把端粒的重复序列加到染色体DNA的末端上,使端粒延长。
6．核酶:核酸类酶。
为一类具有生物催化功能的核糖核酸分子。
它可以催化本身RNA剪切或剪接作用，还可以催化其他RNA，DNA多糖，酯类等分子进行反应。
7．KS分段盐析：指在一定温度和PH值条件下，通过改变离子强度使不同的酶和蛋白质分离的方法.8．B分段盐析：指在盐和离子强度条件下，通过改变温度和PH使不同的酶或蛋白质分离的方法.9．凝胶层析：又称凝胶过滤,分子排阻层析，分子筛层析等。
酶工程实验doc
酶工程实验指导实验一从植物材料中提取制备过氧化物酶一．实验目的学习从植物材料中制备过氧化物酶的方法，了解纯化酶的一些基本步骤。
比较不同植物材料过氧化物酶的含量与活性，掌握酶纯化的相关计算方法。
二．实验原理过氧化物酶（EC 1. 11. 1. 7）是一类以铁卟啉为辅基的氧化酶，在细胞代谢的氧化还原过程中起重要作用，在工业上也广泛被应用。
过氧化物酶可溶于水，溶解度约为5%（W/V），溶液呈棕红色，透明。
此酶可溶于0.58饱和度以下的硫酸铵溶液，而在0.62饱和度以上则不溶。
该酶能催化愈创木酚反应产生有色物质：以此可进行酶活性的测定。
许多植物如辣根、柑桔叶子、白萝卜等含有较多的过氧化物酶，在这些植物材料的溶出物中，加入不同浓度的硫酸铵进行分段盐析，对过氧化物酶进行粗提，然后用有机溶剂沉淀、结晶等方法可对该酶进行纯化，得出较纯的制品。
三．主要仪器与试剂仪器：组织捣碎机，冰箱，真空冷冻干燥机，离心机，紫外-可见分光光度计等。
试剂：愈创木酚，丙酮，过氧化氢，硫酸铵等。
四．实验步骤（尽量在冰浴中进行）鲜植物样品约70克，剪碎或捣烂，加少许水研磨成浆（可用捣碎机），转移到500ml的烧杯中，加水至约200ml，于冰箱中浸提约2小时（中间多次搅动）。
多层纱布挤压过滤后离心（4000rpm），10ml上清液用来测酶活力，其余上清液按226克/升加硫酸铵盐析，冰箱中静置1小时以上，离心(4000rpm)去沉淀。
上清液再按258克/升加硫酸铵盐析，冰箱中静置4小时以上。
离心收集沉淀，用水溶解至约10ml，用水透析去盐，离心去沉淀，取部分酶液稀释后测酶活。
其余酶液用作精制样品。
在搅动下沿着杯壁加入一倍体积预冷(-15℃)的丙酮于酶液中，混匀，静置10分钟，低温离心(8000rpm, 4℃) 去沉淀。
按上清液与丙酮之比为1比0.8再次加入预冷丙酮，静置10分钟后离心(8000rpm, 4℃) 收集沉淀，溶于少量水中，透析去丙酮。
酶工程实验
11111.谷物种子萌发时淀粉酶活力的测定几乎所有植物中都存在淀粉酶，尤其是萌发的禾谷类种子，淀粉酶活性最强。
主要是α-淀粉酶和β-淀粉酶。
种子萌发时，淀粉酶活性随萌发时间迅速增加，将淀粉分解成小分子糖类，供幼苗生长。
α-淀粉酶随机水解淀粉的α-1，4-糖苷键，作为淀粉分解的起始酶而起主要作用；其水解产物为麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原性糖；β-淀粉酶水解非还原端的第二个α-1，4-糖苷键，水解产物为麦芽糖，并能使一部分糊精糖化。
本实验以萌发种子为材料，测定其中α-淀粉酶和β-淀粉酶活性的差异。
【原理】两种淀粉酶具有不同理化特性，α-淀粉酶不耐酸，在PH3 6以下迅速钝化；β-淀粉酶不耐热，在70℃下15Min则被钝化。
据此，在测定时钝化其中之一，就可以测定出另一种酶的活力，本实验采用加热钝化β-淀粉酶测出α-淀粉酶活力，再与非钝化条件下测得的总淀粉酶活力比较，求出β-淀粉酶活力。
淀粉的水解产物麦芽糖及其他还原性糖能与3，5-二硝基水杨酸试剂反应，使其还原生成红色3-氨基-5-硝基水杨酸。
在一定范围内，其颜色深浅与淀粉酶水解产物的浓度成正比，可用麦芽糖(或葡萄糖)浓度表示，用比色法测定淀粉生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。
【仪器与用具】分光光度计；离心机；恒温水浴器；研钵；具塞刻度试管25Ml 13支，刻度吸管1ml、2ml、5Ml各1支；容量瓶50Ml 2支。
【试剂】麦芽糖标准液(1Mg／Ml)：称取100Mg麦芽糖，用蒸馏水溶解并定容至100Ml。
DNS试剂(3，5-二硝基水杨酸)：精确称取3，5-二硝基水杨酸1g，溶于20Ml 12Mol／L NAOH 溶液中，加入50Ml蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水定容至100Ml。
盖紧瓶塞，勿使CO2进入。
若溶液混浊，可过滤后使用。
0 1Mol／L PH5 6的柠檬酸缓冲液：A液(0 1Mol／L柠檬酸)：称取分析纯柠檬酸21 01g，用蒸馏水溶解并定容至1L；B液（0 1Mol／L柠檬酸钠）：称取柠檬酸钠29 41g用蒸馏水溶解并定容至1L；取A液55Ml与B液145Ml混匀，即为0 1Mol／L PH5 6的柠檬酸缓冲液。
酶工程实验指导课件.doc
广东省高教厅重点实验室——现代生物技术实验室教材酶工程实验技术华南农业大学广东省教育厅现代生物技术重点实验室酶工程分室2007年11月编者的话华南农业大学现代生物技术实验室酶工程分室是由广东省高教厅和华农大投资建设的教学提高型实验室，面向石牌地区六所高校的高年级本科生及硕士、博士研究生开设《酶工程实验技术》课程。
该课程以实验为主，为保证学生在修读本课程时有较好的理论基础，要求所有学生预修―酶工程与蛋白质工程‖。
本课程实验内容分酶源的获取、酶制剂分离纯化及分析鉴定、酶制剂的体外改造、酶制剂的应用和酶基因的重组表达五大部分，具体如下：内容实验序号实验项目名称I、酶源的获取1，5 产淀粉酶菌株的快速筛选、木瓜蛋白酶制剂的制备2 鸡蛋清溶菌酶的磁性亲和分离II 、酶制剂的分离纯化及鉴定分析3 纯化鸡蛋清溶菌酶的纯度分析4 纯化鸡蛋清溶菌酶的热稳定性分析5木瓜蛋白酶制剂的制备6 壳聚糖凝胶颗粒固定化木瓜蛋白酶III 、酶制剂的体外改造*实验8 中过氧化物酶在滤纸上固定化的部分亦属此部分内容。
7 酶反应器设计及酪蛋白水解物的制备IV 、酶制剂的应8 消毒液中过氧化氢浓度的酶试纸法测定用9 邻苯二酚双加氧酶基因在大肠杆菌中的高效重组表达V 酶基因的重组表达VI 实验总结及实验总结等。
演示等为满足课程教学的需要，经反复修改，特编写了本实验教材。
本实验指导的编写由王炜军，郭振飞，方颖、刘娥娥老师参加编写，在此一并表示感谢！本实验指导为试用第五版，试用后我们将根据各校修课的情况作进一步修改，敬请兄弟院校的同行多提宝贵意见。
2实验一、产淀粉酶菌株的快速筛选一、目的学习和掌握分泌目的酶菌株的基本原理和筛选方法。
二、原理产淀粉酶的菌株能分泌淀粉酶到菌落周围的培养基中，从而水解培养基中的淀粉，由于使用的是经活性染料标记的带颜色的淀粉（本实验为RBV- 淀粉，呈鲜艳的紫红色），当其被淀粉酶作用后便形成可溶，且较易扩散的小分水解物，从而在该菌落周围形成颜色较浅的透明圈。
酶工程实验1-2
六、实验作业
1、为什么诱导前需要进行菌种活化？ 2、原核表达基因工程菌的诱导过程。 3、原核表达包涵体形成机制。 4、减少包涵体形成的策略。 5、原核表达后为什么要进行细胞破碎，细胞破碎的 方法及其原理。 6、什么是His-tag和GST-tag？有何作用。
谢 谢 ！ 再 见 ！
三、实验材料与试剂
大肠杆菌pET30a-kerA和pET32a-manA，NaCl ，酵母浸出物，蛋白胨，IPTG等。
四、实验仪器设备
细菌培养箱、细菌振荡培养箱、高压灭菌锅
、电子天平，电炉，量筒等。
五、实验步骤
1、大肠杆菌pET30a-kerA和pET32a-manA的活化 1）、手持金属接种环，用酒精灯将接种环（共约 5公分） 烧至火红，并不断来回烧烤金属固定杆之前约 10公分，等待至 接种环完全冷却，将接种环前端轻触甘油保菌液（含大肠杆菌 pET30a-kerA 和 pET32a-manA ），由培养基边缘向中央轻轻 横划紧接的并行线，直到涵盖1/3 培养基为止（І区）。 2）、灼伤接种环，待冷却后，旋转培养基自 І 区涂布的边 缘再横划数条线到未接种的区域（ІІ区）。 3）、重复2的动作完成ІІІ区和ІV区。
二、实验原理
2、外源基因的诱导表达 提高外源基因表达水平的基本手段之一， 就是将宿主菌的生长与外源基因的表达分成 两个阶段，以减轻宿主菌的负荷。 常用的有温度诱导和药物诱导。 本实验采用异丙基硫代 -β-D- 半乳糖昔 （IPTG）诱导外源基因表达。 不同的表达质粒表达方法并不完全相同， 因启动子不同，诱导表达要根据具体情况而 定。
试验一 原核表达原理及试验前准备
一、实验目的与要求
1、掌握原核表达原理。 2、掌握原核表达的试验前准备工作。
关于酶工程实验报告
一、实验目的1. 理解酶工程的基本原理和实验方法。
2. 学习酶的制备、纯化和活性测定等实验技术。
3. 掌握酶的催化特性和应用。
二、实验原理酶工程是指利用酶的催化特性，通过基因工程、蛋白质工程等手段，改造或制备具有特定功能的酶，以满足工业、医药、环保等领域的需求。
本实验通过制备、纯化和活性测定等方法，研究酶的催化特性和应用。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：酶源（如淀粉酶、蛋白酶等）、底物（如淀粉、蛋白质等）、缓冲液、指示剂等。
2. 实验仪器：离心机、电泳仪、紫外分光光度计、酶标仪等。
四、实验步骤1. 酶的制备（1）酶源培养：将酶源接种于培养基中，在适宜条件下培养，使其大量繁殖。
（2）酶提取：将培养好的酶源进行离心分离，收集上清液。
（3）酶浓缩：采用透析、超滤等方法，去除酶液中的杂质，提高酶的浓度。
2. 酶的纯化（1）离子交换层析：根据酶的等电点，选择合适的离子交换树脂，进行酶的吸附和洗脱。
（2）凝胶过滤层析：根据酶的分子量，选择合适的凝胶过滤柱，对酶进行分离和纯化。
3. 酶的活性测定（1）酶活力单位：采用紫外分光光度法测定酶的活性。
（2）酶催化反应速率：测定酶催化底物反应的速率，计算酶的活力。
4. 酶的催化特性研究（1）温度对酶活性的影响：在不同温度下测定酶的活性，研究温度对酶活性的影响。
（2）pH对酶活性的影响：在不同pH值下测定酶的活性，研究pH对酶活性的影响。
五、实验结果与分析1. 酶的制备通过酶源培养、酶提取和酶浓缩等步骤，成功制备了酶液，酶浓度达到实验要求。
2. 酶的纯化通过离子交换层析和凝胶过滤层析，成功纯化了酶，纯度达到95%以上。
3. 酶的活性测定酶活力单位为：X U/mL；酶催化反应速率为：Y mol/min。
4. 酶的催化特性研究（1）温度对酶活性的影响：在30℃时，酶活性最高，随着温度升高，酶活性逐渐降低。
（2）pH对酶活性的影响：在pH 7.0时，酶活性最高，随着pH值的变化，酶活性逐渐降低。
酶工程实验
实验1、大蒜细胞SOD的提取和分离一、原理超氧化物歧化酶（SOD）是一种具有抗氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶。
它可催化超氧负离子（O2-）进行歧化反应，生成氧和过氧化氢。
大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的SOD，通过组织或细胞破碎后，可用pH7.8磷酸缓冲液提取出。
由于SOD不溶于丙酮，可用丙酮将其沉淀析出。
二、材料和试剂1、新鲜蒜瓣2、0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）3、氯仿-乙醇混合液：氯仿:无水乙醇=3:54、丙酮：用前需预冷至4-10℃5、0.05mol/L碳酸盐缓冲液（pH10.2）6、0.1mol/L EDTA溶液7、2mmol/L肾上腺素溶液三、步骤1、组织细胞破碎：称取5g大蒜蒜瓣，置于研钵中研磨。
2、SOD的提取：破碎后的组织中加入2-3倍体积的0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8），继续研磨20min，使SOD充分溶解到缓冲液中，然后在5000rpm下离心15min，取上清液。
3、除杂蛋白：上清液加入0.25体积的氯仿-乙醇混合液搅拌15min，5000rpm离心15min，得到的上清液为粗酶液。
4、SOD的沉淀分离：粗酶液中加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，5000rpm离心15min，得SOD沉淀。
将SOD沉淀溶于0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）中，于55-60℃热处理15 min，得到SOD酶液。
5、SOD活力测定将上述提取液、粗酶液和酶液分别取样，测定各自的SOD活力。
试剂空白管对照管样品管碳酸缓冲液 5.0 5.0 5.0EDTA溶液0.5 0.5 0.5蒸馏水0.5 0.5 -样品液- - 0.5混合均匀，在30℃水浴中预热5min肾上腺素溶液- 0.5 0.5加入肾上腺素后，继续保温2min，然后立即在480nm处测定光密度。
对照管和样品管的光密度值分别为A和B。
在上述条件下，SOD抑制肾上腺素自氧化50%所需的酶量定义为一个酶活力单位。
酶工程实验报告一
酶工程实验报告一一、实验目的本次酶工程实验的主要目的是通过实际操作，深入了解酶的性质、作用机制以及酶的分离纯化和活性测定方法。
同时，培养我们的实验操作技能、观察分析能力和科学思维方法，为今后从事相关领域的研究和工作打下坚实的基础。
二、实验原理酶是一种具有生物催化功能的蛋白质或 RNA 分子。
它们能够在温和的条件下高效地催化各种化学反应，具有高度的特异性和催化效率。
本实验中所涉及的酶主要是蛋白酶和淀粉酶。
蛋白酶能够水解蛋白质中的肽键，将蛋白质分解为小分子肽和氨基酸。
其活性可以通过测定水解产物的生成量或底物的消耗量来进行评估。
淀粉酶能够水解淀粉分子中的α-1,4 糖苷键，将淀粉分解为麦芽糖和葡萄糖等小分子物质。
其活性通常通过测定淀粉的水解程度来确定，常用的方法是碘量法。
酶的分离纯化是基于酶与杂质在物理化学性质上的差异，如溶解度、分子大小、电荷性质等，采用一系列的分离技术，如沉淀、层析、电泳等，逐步去除杂质，获得高纯度的酶。
三、实验材料与设备1、实验材料蛋白酶提取液淀粉酶提取液酪蛋白淀粉溶液福林酚试剂碘液其他化学试剂2、实验设备离心机分光光度计恒温水浴锅移液器电泳仪层析柱四、实验步骤制备酪蛋白底物溶液：称取一定量的酪蛋白，用氢氧化钠溶液溶解，调节 pH 至适宜值，定容备用。
设定反应体系：在试管中依次加入适量的蛋白酶提取液、酪蛋白底物溶液和缓冲液，混合均匀，置于恒温水浴锅中反应一定时间。
终止反应：反应结束后，加入三氯乙酸溶液终止反应。
测定吸光度：离心去除沉淀，取上清液，加入福林酚试剂显色，在分光光度计上测定吸光度。
计算蛋白酶活性：根据标准曲线计算出反应生成的酪氨酸量，从而计算出蛋白酶的活性。
2、淀粉酶活性的测定制备淀粉溶液：称取一定量的淀粉，用缓冲液溶解，加热糊化，冷却后定容备用。
设定反应体系：在试管中依次加入适量的淀粉酶提取液、淀粉溶液和缓冲液，混合均匀，置于恒温水浴锅中反应一定时间。
终止反应：反应结束后，加入碘液终止反应。
(完整word版)酶工程_试题及答案
《酶工程》试题一参考答案：一、填空题(每空1分，共28分）1、日本称为“酵素”的东西，中文称为酶，英文则为Enzyme,是库尼（Kuhne）于1878年首先使用的。
其实它存在于生物体的细胞内与细胞外。
2、1926年，萨姆纳（Sumner）首先制得脲酶结晶，并指出酶的本质是蛋白质。
他因这一杰出贡献，获1947年度诺贝尔化学奖.3、目前我国广泛使用的高产糖比酶优良菌株菌号为As3.4309,高产液化酶优良菌株菌号为BF7。
658。
在微生物分类上，前者属于霉菌,后者属于细菌。
4、1960年，查柯柏（Jacob）和莫洛德（Monod）提出了操纵子学说，认为DNA分子中，与酶生物合成有关的基因有四种，即操纵基因、调节基因、启动基因和结构基因。
5、借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法.6、酶的分离纯化方法中，根据目的酶与杂质分子大小差别有凝胶过滤法，超滤法和超离心法三种。
7、由于各种分子形成结晶条件的不同,也由于变性的蛋白质和酶不能形成结晶，因此酶结晶既是纯化手段，也是纯化标志。
名词术语的解释与区别(每组6分，共30分）1、酶生物合成中的转录与翻译酶合成中的转录是指以核苷三磷酸为底物，以DNA链为模板,在RNA聚合酶的作用下合成RNA分子。
酶合成中的翻译是指以氨基酸为底物，以mRNA为模板，在酶和辅助因子的共同作用下合成蛋白质的多肽链。
2、诱导与阻遏酶合成的诱导是指加入某种物质使酶的合成开始或加速进行的过程;酶合成的阻遏作用则是指加入某种物质使酶的合成中止或减缓进行的过程.这些物质分别称为诱导物及阻遏物。
3、酶回收率与酶纯化比（纯度提高比）酶的回收率是指某纯化步骤后酶的总活力与该步骤前的总活力之比。
酶的纯化比是之某纯化步骤后的酶的比活力与该步骤前的比活力之比.4、酶的变性与酶的失活酶的变性是指酶分子结构中的氢键、二硫键及范德华力被破坏,酶的空间结构也受到破坏,原来有序、完整的结构变成了无序，松散的结构，失去了原有的生理功能.酶的失活则是指酶的自身活性受损（包括辅酶、金属离子受损），失去了与底物结合的能力。
部分修改-酶工程实验-权春善
实验一紫外吸收法测定蛋白质含量一、实验目的学会用紫外吸收法测定蛋白质含量的方法。
二、实验仪器紫外分光光度计三、实验原理大多数蛋白质由于有酪氨酸和色氨酸的存在，在紫外光280 nm有吸收高峰，可以进行蛋白质含量的测定。
但是核酸在280 nm也有吸收，干扰测定，不过核酸的最大吸收峰在260 nm，warburg等测定了酵母烯醇酶和酵母核酸在280 nm和260 nm时吸光值（A）的比值，然后通过计算消除核酸存在的影响，可以求得有核酸存在时蛋白质的浓度。
该方法是以酵母烯醇酶蛋白和酵母核酸为标准建立计算公式，而不同蛋白质的氨基酸组成也不同，因而光吸收也不尽相同，这就会带来一定的误差。
四、方法步骤1．取待测样品溶液置于光径1cm的石英比色杯中，于紫外分光光度计波长280 nm和260 nm，分别读取A280和A260，用蒸馏水（缓冲溶液或盐溶液，视样品溶液而定）为比色空白对照。
2．根据下列公式计算样品中的蛋白质含量。
蛋白质含量（mg/ml）=1.55A280—0.76A260五、实验报告计算所测材料蛋白质的含量。
六、思考题1．测定蛋白质含量的方法有哪些，它们所根据的原理是什么？2．试比较测定蛋白质含量的几种方法的优缺点。
实验二蛋白酶活性的测定方法一、实验目的（1）了解蛋白酶活力测定的原理（2）掌握蛋白酶活性的测定方法。
二、实验原理蛋白酶在一定的条件下不仅能够水解蛋白质中的肽键，也能够水解酰胺键和酯键，因此可用蛋白质或人工合成的酰胺及酯类化合物作为底物来测定蛋白酶的活性。
本实验选用酪蛋白为底物，测定微生物蛋白酶水解肽键的活力。
酪蛋白经蛋白酶水解后，降解成相对分子量较小的肽和氨基酸，在反应混合物中加入三氯醋酸溶液，相对分子量较大的蛋白质和肽就沉淀下来，相对分子量较小的肽和氨基酸仍留在溶液中，溶解于三氯醋酸中的肽的数量正比于酶的数量和反应时间。
在275 nm波长下测定溶液吸光度的增加，就可以计算出酶的活力。
三、实验试剂1. 1%酪蛋白溶液：2. 10%三氯醋酸（TCA）溶液：四、实验步骤1.酶活定义：在温度40℃pH7.5 条件下，每分钟水解酪蛋白生成l μg酪氨酸所需的酶量为一个活力单位。
酶工程实验报告
酶工程实验报告指导老师：学号：20070830姓名：班级：生物技术班**师范大学生命科学学院07级2010-11-15生物工程实验指导（酶工程部分）实验一木瓜蛋白酶的分离纯化及酶活检测一、概述以半胱氨酸内肽酶为主（包括木瓜蛋白酶，简称PAP、木瓜蛋白酶Ω，简称CAR、木瓜凝乳蛋白酶，简称CHP和木瓜凝乳蛋白酶M，简称GEP）的木瓜蛋白酶是从植物番木瓜中分离纯化而得的一种混合酶。
这种酶广泛存在于番木瓜的根、茎、叶和果实内，其中以为成熟的果实乳汁中含量最高，约占乳汁干中的40%。
其最大的用途是在食品工业方面，防除啤酒冷藏混浊，嫩化肉类，生产调味品，烘烤面包，乳酪制品及谷类和速溶食品的蛋白质强化生产。
在动物饲料加工方面，用于鱼蛋白浓缩物和油籽饼处理，能提高氮的可溶性指数和蛋白质的可分散指数。
少量在皮革工业作软化剂、纺织工业作丝织品脱胶清洁剂和废胶卷回收报等。
在医药方面，主要用于治胃炎、消化不良以及用于肉赘摘除、伤痕处理、脱毛、清洁皮肤和新近的裂腭整形外科及制木瓜凝乳蛋白酶注射剂治疗脊骨盘脱出症等。
木瓜蛋白酶是一种巯基蛋白酶，其专一性较差，能分解比胰脏蛋白酶更多的蛋白质。
木瓜蛋白酶是单条链，有211个氨基酸残基组，相对分子量23000。
木瓜凝乳蛋白酶，相对分子量36000，约占可溶性蛋白质的45%。
溶菌酶，相对分子量2500，约占可溶性蛋白质的20%。
木瓜蛋白酶为白色、淡褐色无定型粉末或颗粒。
略溶于水、甘油，不溶于乙醚、乙醇和氯仿。
水溶液无色至淡黄色，有时呈乳白色。
最适pH为5.0～8.0，微吸湿，有硫化氰臭。
最适温度65℃，易变性失活。
木瓜蛋白酶等电点pH＝9.6。
半胱氨酸、硫化物、亚硫酸盐和EDTA是木瓜蛋白酶激活剂，巯基试剂和过氧化氢是木瓜蛋白酶的抑制剂。
二、实验目的1、学习和掌握木瓜蛋白酶分离纯化的原理、方法和工艺过程，包括盐析、酶活力保护、结晶与重结晶。
2、掌握木瓜蛋白酶活力的测定方法和原理。
酶工程实验讲义
实验一酵母蔗糖酶的提取一、原理酵母中含有丰富的蔗糖酶(EC.3.2.1.26)，本实验以酵母为原料，通过超声波破碎细胞、硫酸铵沉淀等步骤，分离纯化酵母蔗糖酶。
二、实验材料、仪器和试剂1.材料活性干酵母2.仪器(1)高速离心机(2)恒温水浴锅(3)超声破碎仪3.试剂(1)1 mol/L醋酸溶液三、操作步骤1.破碎细胞取5 g干酵母，加5 g石英砂，置于预先冷却的研钵中，加30 mL去离子水，研磨30 min，在冰箱中冰冻约10 min（研磨液面上刚出现冰结为宜），重复2次。
将研磨液转移至大离心管中，12000 r/min离心15 min，弃去沉淀。
2.加热除杂蛋白将上清液转入三角瓶，用1 mol/L醋酸溶液逐滴加入，调其pH值至5.0，然后迅速放入50℃的水浴中，保温30 min。
在温育过程中，注意经常缓慢搅拌液体。
之后在冰浴中迅速冷却之，以12000 r/min的转速离心20 min，弃去沉淀。
留0.5 mL上清液为第二组分。
3.乙醇沉淀量出上清液的体积，加入等体积的95%冷乙醇溶液(预先放在-20℃低温下的时间不少于30 min)，于冰浴中温和搅拌20 min。
然后以12000 r/min的转速离心25 min，小心弃去上清液，沉淀沥干。
将沉淀溶解在6 mL 0.05 mol/L Tris-HCl 缓冲液(pH值7.3)中，搅拌(5 min以上)使其完全溶解，以12000 r/min的转速离心25 min，取出0.5 mL上清液作为第三组分，剩余部分(乙醇抽提液)进行第4步操作。
用尿糖试纸进行半定量测定：在白瓷板每孔中分别滴3滴待测酶液，再加3滴含5％蔗糖的pH 4.6的醋酸缓冲液，搅匀，37℃放置10 min，浸入尿糖试纸，1 s后取出，60 s后比较颜色的深浅，与比色卡对照。
尿糖试纸的原理：尿糖试纸是将葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶及无色的化合物固定在纸条上，制成的测试尿糖含量的酶试纸。
溶液（或尿液）中的葡萄糖在葡萄糖氧化酶的催化作用下，形成葡萄糖酸和过氧化氢；过氧化氢在过氧化氢酶的催化作用下形成水和原子氧；原子氧可将某种无色的化合物氧化成有色的化合物。
酶工程实验
酶工程实验实验一、纤维素酶活力测定及酶促动力学研究一、原理:酶促动力学研究酶促反应的速度及影响速度的各种因素，而米氏常数K m值等于酶促反应速度为最大速度一般时所对应的底物浓度，其值大小与酶的浓度无关，是酶促反应的特征常数。
不同酶的K m值不同，同一种酶与不同的底物反应时，其K m值也不同，K m值反映了酶和底物亲和力的强弱程度，K m值越大，表明酶和底物的亲和力越弱；K m值越小，表明酶与底物的亲和力越强。
酶的活力就是酶催化的反应速度，通常用单位时间内底物的减少或产物的增加来表示。
酶反应过程中产物的生成和时间的关系可以用进程曲线来说明，曲线的斜率就是酶反应过程中的反应速度。
从进程曲线来看，在一定时间内反应速度维持恒定，但随着时间的延长，反应速度逐渐降低，这是由多种因素造成的。
所以，为了准确表示酶的反应速度必须采用初速度，即保持恒定时的速度。
同样，不同酶浓度下的反应进程曲线也可以说明这个问题。
酶活力可以被某些物质改变，凡能降低酶的活力甚至使酶失活的物质，均称为抑制剂，分为可逆抑制和不可逆抑制两种类型。
可逆抑制包括竞争性抑制、非竞争性抑制等类型。
在有抑制剂存在的条件下，酶的一些动力学性质会发生改变，如K m，V max等，可通过作图法求得，作图法很多，最常用的就是Lineweaver-Burk作图法（即双倒数作图法）。
二、仪器和试剂1、仪器: (1)恒温水浴锅（2）电炉（3）722分光光度计（4）试管、移液管若干2、试剂: （1）DNS溶液(结晶酚、氢氧化钠、亚硫酸氢钠、酒石酸钾钠、3，5-二硝基水杨酸) （2）2.5mmol/L 葡萄糖溶液（3）0.5%羧甲基纤维素钠溶液（4）1mg/ml纤维素酶溶液（5）磷酸缓冲液pH5.8 （6）8mol/lL 脲（mL）（7）蒸馏水三、操作步骤1、标准曲线绘制: 用浓度为2.5mmol/L的葡萄糖溶液配制终浓度分别为0.05、0.1、0.15、0.2、0.25（mmol/L）葡萄糖溶液进行实验。
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实验一过氧化氢酶米氏常数的测定一、目的了解米氏常数的意义，测定过氧化氢酶的米氏常数。
二、实验原理H2O2被过氧化氢酶分解出H2O和O2，未分解的H2O2用KMNO4在酸性环境中滴定，根据反应前后H2O2的浓度差可求出反应速度。
本实验以马铃薯提供过氧化氢酶，以1/ν~1/[S]作图求Km三、实验器材1.锥形瓶100～150ml（×6）。
2.吸管1.0ml（×2）、0.5ml（×2）、2.0ml（×2）、5ml（×2）、10.0ml（×1）。
3.温度计（0～100℃）。
4.微量滴定管5ml（×1）。
5.容量瓶1000ml（×1）。
四、实验试剂1、0.02mol/L磷酸缓冲液（Ph7.0）取磷酸二氢钾 0.68g，加0.1mol/L氢氧化钠溶液 29.1ml，用水稀释至100ml,即得。
2、酶液：称取马铃薯5g，加上述缓冲液10ml，匀浆，过滤。
3、0.02mol/L KMnO4：称取KMnO4（AR）3.2g，加蒸馏水1000ml，煮沸15min，2d后过滤，棕色瓶保存。
4、0.004mol/L KMnO4：准确称取恒重草酸钠0.2g，加250ml冷沸水及10ml浓硫酸，搅拌溶解，用0.02ml/L的KMnO4滴定至微红色，水浴，加热至65℃，继续滴定至溶液微红色并30s不褪，算出KMnO4的准确浓度稀释成0.004mol/L即可。
5、0.05 mol/L H2O2：取30% H2O223ml加入1000ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度（约0.2mol/L），用标准KMnO4（0.004mol/L）标定其准确浓度，稀释成0.05mol/L（标定前稀释4倍，取2.0ml，加25% H2SO42.0ml，用0.004mol/LKMnO4滴定至微红色）。
6、25% H2SO4五、操作取锥形瓶6只，按下表顺序加入试剂：表一过氧化氢酶米氏常数的测定管号试剂0123450.05mol/L H2O2/ml蒸馏水/ml酶液/ml9.50.51.008.500.51.258.250.51.677.830.52.57.00.55.004.500.5先加好0.05mol/L H2O2及蒸馏水，加酶液后立即混合，依次记录各瓶的起始反应时间。
各瓶时间达5min时立即加 2.0ml 25%硫酸终止反应，充分混匀。
用0.004mol/L KMnO4滴定各瓶中剩余的H2O2至微红色，记录消耗的KMnO4体积。
六、计算分别求出各瓶的底物浓度[S]和反应速度v。
[S]=c1V1/10式中[S]：底物物质的量浓度（mol/L）；c1：H2O2物质的量浓度（mol/L）；V1：H2O2体积（ml）；10：反应的总体积（ml）；υ：反应速度（m mol/min）；c2：KMnO4物质的量浓度（mol/L）；V2：KMnO4体积（ml）；以1/υ对1/[S]作图求出Km。
实验二酶促反应中初速度时间范围测定一、实验目的1.了解酶促反应中初速度时间范围测定的基本原理；2.掌握酶促反应中初速度时间范围的测定方法。
二、实验原理酸性磷酸酯酶（acid phosphatase, EC 3.1.3.2）广泛分布于动植物体中，尤其是植物的种子、动物肝脏和人体的前列腺中。
它对生物体内核苷酸、磷蛋白和磷脂的代谢起着重要作用。
酸性磷酸酯酶能专一性水解磷酸单酯键。
以人工合成的对硝基苯磷酸酯（4-nitrophenyl phosphate, NPP）作底物，水解产生对硝基苯酚和磷酸。
在碱性溶液中，对硝基酚的盐离子于405nm处光吸收强烈，而底物没有这种特性。
利用产物的这种特性，可以定量的测定产物的生成量，从而求得酶的活力单位。
即通过测定单位时间内405nm处光吸收值的变化来确定酸性磷酸酯酶的活性。
酸性磷酸酯酶的一个活力单位是指在酶反应的最适条件下，每分钟生成1μmol产物所需的酶量。
要进行酶活力测定，首先要确定酶反应时间。
而酶的反应时间应该在初速度时间范围内选择。
可以通过进程曲线的制作来求出酶的初速度时间范围。
进程曲线的制作是指在酶反应的最适条件下，采用每隔一定时间测定产物生成量，以酶反应时间为横坐标，产物生成量为纵坐标绘制而成。
从进程曲线可知，在曲线起始的一段时间内为直线，其斜率代表初速度。
随着反应时间的延长，曲线趋于平坦，斜率变小，反应速度下降。
要真实反映出酶活力大小，就应在初速度时间内测定。
三、实验试剂与器材1.试剂（1）酸性磷酸酯酶原液（从绿豆芽中提取）（2）酸性磷酸酯酶液（通过原酶液稀释得到）取原酶液，用0.05mol/L、pH5.0柠檬酸盐缓冲液稀释，使进程曲线中第11号管吸光度A在0.6～0.7之间。
405（3）1.2mmol/L对硝基苯磷酸酯精确称取NPP0.4454g，加缓冲液定容至100mL。
（4）0.3mol/LNaOH溶液2．器材恒温水浴槽，可见分光光度计，试管，刻度吸管，离心机。
四、操作步骤1.酸性磷酸酯酶原酶液的制备称取一定重量的绿豆，浸泡24h，在25～30°C温箱中培养5～7d。
长出的豆芽取其颈部，依次用自来水和重蒸水冲洗干净，置滤纸上吸干水分，称30g 放入研钵中匀浆，加0.2mol/L乙酸盐缓冲液4mL，置4°C冰箱中6h以上。
然后用双层纱布挤压过滤，滤液6000r/min离心15min,上清液置透析袋用蒸馏水充分透析，间隔换水10次，透析24h以上。
将透析后酶液稀释至最终体积与豆芽质量（g）相等，以6000r/min离心30min，所得上清液即为原酶液，置冰箱待用。
2.酶促反应取试管12支，按表1.1编号，0号为空白。
各管加入1.0mL1.2mol/LNPP；另外2支试管，各加入稀释好的酶液7mL，在酶反应前底物与酶都放入35°C恒温水浴槽中预热2min。
然后向1～11号管内各加入1.0mL预热的酶液。
立即摇匀并开始计时。
按时间间隔为3min、5min、7min、10min、12min、15min、20min、25min、30min、40min、50min进行反应。
待反应进行到上述各相应时间时，加入3.0mL 0.3mol/L NaOH终止反应。
冷却后以0号管作空白（0号管加入1.0mL NPP 后保温25min，然后加入3.0mL 0.3mol/L NaOH，再加入1.0mL酶液），在分光光值。
度计上测定各管A4053.数据处理值为纵坐标绘制进程曲线。
由进程曲线中直线部以反应时间为横坐标，A405分求出酸性磷酸酯酶反应初速度的时间范围。
表1.1 制作酶促反应进程曲线时各物质加入量五、实验报告绘出酶促反应进程曲线，记录实验结果，计算酸性磷酸酯酶反应初速度的时间范围。
实验三酵母蔗糖酶的部分纯化与酶活测定一、目的：了解酶的纯化方法。
二、原理：酵母中含有丰富的蔗糖酶(EC.3.2.1.26)，本实验以酵母为原料，通过破碎细胞方式得到粗酶，并用热变性法除杂蛋白纯化。
（请参考相关教材）三、试剂与仪器1、试剂与材料：(1)干酵母(2)石英砂(3)1 mol/L醋酸溶液(4)2 mol/L氢氧化钠溶液(5)醋酸缓冲液（pH 4.6）(6)5% 蔗糖溶液(7)D NS（3,5-二硝基水杨酸）试剂2、仪器：电子天平、离心机、分光光度计、水浴锅、电炉、研钵、试管、三角瓶、量筒、移液管。
四、操作方法1、破碎细胞取2 g干酵母于研钵中，加入2 g石英砂，加30 ml去离子水，研磨15 min，放入冰箱冷冻室（-20℃）冰冻约20 min（研磨液面上刚出现冰结为宜）。
取出冷冻酵母，再研磨5 min后，在5000 r/min条件下离心12 min，小心取出上清液（组分一）并量出体积V，分别取0.5 ml上清液到试管A、B中，余1者倒入三角瓶。
2、纯化把三角瓶中的上清液用1 mol/L醋酸溶液调pH 5.0（试纸）。
然后迅速放入到55 ℃的水浴中，保温30 min。
之后在冰浴中迅速冷却。
在5000 r/min条件，分别取0.5 ml上清液到下离心12 min。
取出上清液（组分二）并量出体积V2试管C、D中。
3、酶反应取四支试管，分别按顺序加入反应物：试管中反应物在55 ℃水浴中反应5 min（秒表计时）后，B、D管立即．．各加入1 ml氢氧化钠溶液（2 mol/L）终止反应，A、C管中各加入1 ml蒸馏水。
4、酶催化产物检测取5支试管，分别加入反应物：试管中反应物在沸．水浴中反应5 min，然后冷却。
加入4 ml蒸馏水。
将各试管摇匀，用空白管溶液（5号管）调零点，测定它们的吸光度值A540。
五、结果计算1、酶活力单位的定义：本实验中，蔗糖酶的活力单位指在55℃条件下，每1 min 催化底物转化为1 mg 还原糖的酶量。
2、酶活计算：粗酶的计算酶活（组分一）：5.05.45545)(⨯⨯⨯-ABS ABS A B 纯化后酶的计算酶活（组分二）：5.05.45545)(⨯⨯⨯-ABS ABS C D3、总酶活的计算：总酶活1（组分一，粗酶）：计算酶活×稀释倍数⎪⎭⎫⎝⎛5.01V总酶活2（组分二，纯化后酶）：计算酶活×稀释倍数⎪⎭⎫⎝⎛5.02V4、酶活回收率的计算：酶活回收率 = %10012⨯总酶活总酶活附：还原糖和总糖的测定——3,5-二硝基水杨酸比色法还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。
还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。
利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。
还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。
在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm 波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。
实验四蔗糖酶包埋及固定化酶活测定一、目的：了解凝胶包埋法及固定化酶活测定方法。
二、原理：海藻酸钠在遇到Ca2+时成胶，从而把酶包埋在其中。
（请参考相关教材）三、试剂与仪器1、试剂与材料：(8)干酵母(9)海藻酸钠(10)无水氯化钙(11)5% 蔗糖溶液(12)DNS（3,5-二硝基水杨酸）试剂2、仪器：电子天平、分光光度计、水浴锅、电炉、烧杯、玻棒、量筒、试管、量筒、移液管、注射器（带7号针头）、纱布。
四、操作方法4、配A液取0.75 g海藻酸钠溶在25 ml蒸馏水中，沸水浴（勿用电炉直接加热）充分溶胀。