高效液相色谱仪操作手册(戴安全自动)

液相色谱操作规程-U3000（全自动）

一、操作前准备：

1.1流动相的配制：

1.1.1根据所供试品的性质、相关的文献资料、工作经验等按比例配制流动相。

1.1.2根据流动相的性质确定采用有机膜（0.45um）还是水相膜(0.45um)对流动相进行过滤。

1.1.3将过滤后的流动相进行超声脱气10~15分钟。

1.2对照品供试品处理：

1.2.1称取或量取适量的对照品或供试品，用适当的溶剂（最好采用流动相或流动相的主成分）进行充分溶解（也可借助超声波进行超声溶解），使其浓度为

0.1~1mg/mL（根据检测结果再适当调节溶液的浓度）。

1.2.2根据对照品或供试品的性质确定采用有机针头滤膜（0.45um）还是水相针头滤膜(0.45um)进行过滤。

1.3色谱柱的选择：根据样品的性质选择适当的色谱柱。

二、开机：

2.1打开电源，打开仪器接线板电源开关；

2.2打开电脑显示器电源，打开电脑主机电源，启动电脑；

2.3依次打开泵、自动进样器、柱温箱、检测器的电源；等待各个部件自检完成2.4双击屏幕右下角“服务管理器”快捷图标,出现对话界面后点击“启动仪器控制器”启动,等显示“本地仪器控制器运行空闲”,关闭界面。

2.5双击在桌面上的Chromeleon 7图标（工作站主程序）。

2.6在左下方点击仪器，则在右边会自动显示该仪器控制面板

2.7 旋开泵上的排液阀(两圈以上)；设置A通道为100%，点击“冲洗”，然后再出现的对话框中点击“忽略并执行”；（默认冲洗5分钟）；然后用同样的方法分别“冲洗”流路中其他通道气泡；排完气泡后关闭排液阀；

2.8设置流动相的比例及流速后，点击“马达”。此时泵自动会以设置的流速进行运行。

2.9在控制面板“自动进样器”控制框中，分别执行“灌注注射器”，“清洗缓冲环”，“清洗针外壁”,执行“到进样位置”；（操作过程中注意注射器有没有气泡。如有先机器排气，如果不行手动拆除排气泡。）

3.0 在控制面板“柱温箱”控制框中，设置准备分析样品所使用的柱温箱温度。

3.1打开氘灯（待系统压力稳定后约10min后再开灯）：在控制面板“Detector”控制框中，选中“紫外灯”选框，及“可见灯”选框（如果波长在可见范围）。

3.2 在控制面板“UV”控制框中，设置波长，采集频率（10~20HZ）；点击“监视基线”，选中通道1并确定。

3.3在控制面板“FLD”控制框中，设置激发波长及发射波长，灵敏度适当（1~7）；采集频率（10~20HZ）；点击“监视基线（一般30min）”，选中通道Emission_1并确定。(若不需要荧光分析，可忽略此步骤)

三、样品分析：

3.1建立仪器方法：

3.1.1点数据键，选中仪器方法，点创建，选中仪器方法（HPLC），出现对话框，点击下一步，在运行时间栏中填写样品所需要运行的时间，选择所需的通道（若没有要选的通道，点击取消选择所有通道），点击下一步，进入pump（泵）设置，点击常规设置，填写溶剂名称（例如A：乙腈 B：水放置流动相根据情况而定），设置压力限值（下限50 上限350）点击旁边的流速梯度，进入梯度设置，删除平衡阶段，设置流速为（1.0ml/min），按要求填写流动相比例；点击下一步，进入sampler（采样器）设置，将进样冲洗改为AfterDraw(其他设置不用改变)，点击下一步，进入ColumnOven（柱温）设置，一般无要求通常设置为：温度30C；下限5.0；上限110.0；平衡时间0.5min；就绪温度差1.0C；点击下一步，进入UV （紫外）设置，设置按要求所需的紫外波长（通道1），峰宽0.05；点击下一步；进入FLD设置（荧光检测器），若不用蒸发光则不需开FLD；点击下一步，出现对话框，将所需要做的样品名称填写上，点击完成后，再点击左上角保存，即可。全部设置完成后，点击仪器，出现主界面，点击Pump，将流动相比例改成之前设置的比例，再点击UV，将紫外波长改为要求的波长。

注：如需要进行梯度洗脱，则每个时间段的流动相比例不一样，进入泵设置的流速梯度，删除平衡阶段，按要求和时间段填写流动相比例，（每次按要求的时间再延长十分钟且流动相比例与最初0分钟的保持一致）。如果之前有创建，可以直接调用之前的。

3.2建立序列：

3.2.1点击数据键，点序列，创建一个样品文件夹，再点击序列，点创建，点击序列，点击HPLC，点下一步，出现对话框，填写进样名称（样品名）、样品数、进样次数、开始位置、进样量；点击下一步，出现对话框，在浏览中选择所需要的仪器方法（上一步创建仪器方法），点击下一步，点完成，在对象名称栏中填写样品名称，点保存，出现序列，在名称栏中填写所做的样品名称（注明批号），类型栏中填写校准标准品（对照品）或未知（样品），级别栏默认数值，位置栏填写样品瓶的位置；进样量按要求填写所需的进样量，点击保存。

3.3待基线稳定后(一般30min)，点击“监视基线”，点击确定，关闭查看基线。

3.4 将对照品及样品按序列中的位置逐个放在样品盘中；

3.5点击左下方“数据”，并选中要分析的序列，然后点击“开始”启动样品表进行分析（如果序列里有完成的样品，则会变成继续，点继续；如果该序列还在队列中则会显示删除，点击删除后在点击继续）；

3.6样品全部检测结束后，如果不再分析样品应立即关掉氘灯，延长氘灯使用的寿命。

四、数据处理

4.1 方法一：在序列里选择所需要处理的数据双击，点击处理键，出现对话框，选中积分区域，点下一步直到完成。

4.2 方法二：双击图谱在数据处理界面点击校准和数据处理方法，进入界面，在色谱图下方点击“检测”，运行cobra向导执行检测参数的优化，选中要积分的峰，依次进行积分区域、基线噪声（可选择较平滑的一段）、平滑度、最小峰面积通道和进样类型进行选择直至完成。

4.3 打印图谱：点击报告设计器，点总结即可看到所建序列里所有数据；点击旁边的积分，点击页面布局，点页面预览，点击打印，即可。

4.4 打印样品报告。

五、关机：

5.1样品全部检测结束后，如果不再分析样品应立即关掉氘灯，延长氘灯使用的寿命，冲洗色谱柱（如果使用了缓冲盐，首先使用10%甲醇水溶液冲洗色谱柱