蛋白质组学实验

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1.植物蛋白质组学简介
蛋白质组学的概念
PROTEOME：PROTEin与genOME的杂合 蛋白质组学是研究活细胞内基因组编码的全部蛋白质功能的科学。它
是功能基因组学的 “中流砥柱”，是联系基因组序列与细胞功能的重要学
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3. 双向电泳实验
样品制备
通常可采用细胞或组织中的全蛋白质组分进行 蛋白质组分析。也可以进行样品预分级，即将细 胞或P组EG织分中级的沉全淀体法蛋：由白于质P分EG成分子不在同溶部液分中，可分形别成进网 行状结研构究，。与溶液中的蛋白质分子发生空间排斥作用，
使蛋白质分子凝集、沉淀。蛋白质的分子量越大，将 蛋白沉淀所需的PEG浓度越小；PEG的分子量越高，沉 淀蛋白所需的浓度越低。
表面活性剂
消除蛋白质疏水基团之间的相互作用，增强蛋白质在其pI值处的溶解性。 兼性离子型去污剂：CHAPS，浓度2-4%；SB3-10 、ASB-14 非离子型去污剂：NP-40 和Triton-X-100 阴离子型去污剂：SDS，浓度低于0.25%
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还原剂
主要是断裂蛋白质分子中半胱氨酸（Cys）残基之 间形成的二 硫键，增加蛋白质的溶解性。
Reagent
9.5M Urea, 2M Thiourea
1% DTT, 2mM TBP
4% CHAPS
0.2% Carrier ampholytes
所得的F1、 F2、F3、 F4、 F5分别用TCA／丙酮溶液和80 % 丙 酮溶液洗涤至色素完全去除，最后沉淀冻干，放于-80 ℃冰箱待用。
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增加样品溶解性的手段
离液剂 也称变性剂，主要为尿素（urea）和硫尿（Thiourea），破坏 蛋白分子间形成的氢键，防止由氢键引起的蛋白质聚集及蛋 白迁移中二级结构的形成。
4百度文库
生物学问题的 提出
实验模型 的设计
实验组和对照组 样品的制备
感兴趣
蛋白样品的IEF和PAGE电泳分离
技
蛋白点
术
的切取
图像扫描和初步分析
路 胰酶对脱色后蛋白质的消化
线
质谱的多肽指纹图、微测序分析
蛋白信息的初步 获得
质谱结果的生物信息学分析和比对
鉴定差异蛋白质
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其它实验的 进一步验证
蛋白质的表达 亚细胞定位 相互作用 蛋白质的功能
3. 双向电泳实验
样品制备
TCA/acetone法 取1g植物叶片，液氮冷冻研磨，加5mL 含0.2%DTT和20%TCA的冷丙酮溶液匀浆，放置于-20℃冰箱 过夜。之后4℃下13000rpm离心30min，弃上清液，沉淀用 含0.2%的丙酮溶液清洗三次(每次均放于-20℃冰箱沉淀 1h)。最后沉淀冻干，放于-80℃冰箱待用。
植物蛋白质组学实验
1
目录
1 蛋白质组学简介 2 蛋白质组学研究的技术路线 3 双向电泳实验
Intens. [a.u.] Intens. [a.u.]
2
x104
x104
3.0
1236.618 3
2284.112
1416.717 1612.849 2.5
1278.706 2.0
2
964.564
1456.711
3. 双向电泳实验
细胞破碎 蛋白沉淀 蛋白溶解 去除杂质 定量 防止蛋白水解
选择胶条
IPG胶条 重泡胀
电泳
平衡
选择凝胶
灌胶 将IEF胶条 移至第二向 染色
电泳
图像采集 斑点检测 背景消减 凝胶匹配 数据分析
样品制备
第一向电泳 IEF 等电聚焦
第二向电泳 SDS-PAGE
2-DE 实验基本步骤
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图像分析
科。
Proteome包括了一个基因组、一种生物或一种细胞/组织所表达的全
套蛋白质。
基因组
转录组
蛋白组
一门交叉学科
物理学 数学 化学 计算机科学
生物信息学
3
2.技术路线和研究技术
蛋白质组学的研究技术
双向电泳技术、计算机图像分析与大规模数据处理技术和 质谱技术 被称为蛋白质组研究的三大基本支撑技术。
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3.双向电泳实验
聚乙二醇（PEG）分级沉淀法
取黄瓜叶片2 g，液氮冷冻研磨，加入10 mL预冷的Mg／NP-40蛋 白质提取液，混匀，4 ℃下13000 g 离心15 min，弃沉淀，上清液加入 预冷的50 % (w/v) PEG储备液，使PEG终浓度为8 %，冰浴30 min， 2000 g离心10 min，所得沉淀为F2；上清液继续加入预冷的50 % PEG储备液，使PEG终浓度分别为16 %，冰浴30 min，13000g离心 15 min，所得沉淀为F3；上清液继续加入预冷的50 %(w／v) PEG储备 液，使PEG终浓度为24 %，冰浴30 min，13000g离心15 min，所得沉 淀为F4；上清液加入4倍体积的TCA/丙酮溶液，4 ℃下20000g离心15 min，得到的沉淀部分为F5，弃上清液。
2.技术路线和研究技术
生物信息学 分析
ExPASy (Expert Protein Analysis System) 数据 库http://expasy.org/tools/几乎涵盖了所有蛋白质 组学分析工具。如： ProtParam(http://expasy.org/tools/protparam .html)软件能检索蛋白质序列理化参数 PredictProtein （http://www.predictprotein.org/）蛋白质序列 和结构预测服务网站 KEGG数据库（ http:/6/www.genome.jp/kegg）
β-巯基乙醇 DTT 浓度20-100mmol/L TBP (非巯基还原剂，三丁基膦)，浓度2mmol/L
载体两性电解质
代替盐离子，促进蛋白质溶解，吸附高浓度尿素 在溶液中形成的氰酸盐离子， 离心时还有助于核 酸的沉淀。
IPG buffer3-10 或 pH5-8和pH8-10按2:1混合。
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裂解液
2001.078
1 1760.827
2918.340
2604.244
3131.456
1.5
1156.574
1.0 809.364
1094.492
904.506
0.5 985.515
1674.852
1969.071
1742.859 1876.909
2185.143 2362.179
1771.980
2095.015