低温保存对绵羊精子DNA链完整性的影响_徐振军
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
DOI:10.13881/j.cnki.hljxmsy.2012.07.048
56
Heilongjiang Animal Science and Veterinary Medicine
№ 4 2012
低温保存对绵羊精子 DNA 链完整性的影响
徐振军， 张红霞，wenku.baidu.com刘
中图分类号： S826 文献标识码： B
收稿日期：2011 － 07 － 15 ；修回日期：2011 － 07 － 29 基金项目：内蒙古自治区高校科研项目（ NJ09170 ） linkur3@ 126． com． 作者简介：徐振军（ 1965 － ） ， 男， 教授， 硕士，
最敏感、 快速、 特异的新方法， 具有广泛的应用前景。 TUNEL 法是指脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺 将分子生物学方法与形态学方法相结 口末端标记法， ， 合 用来对完整的凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染 能准确地反映细胞凋亡最典型的形态学及生物化 色， ［6 ］ 学特征 。目前， 此方法多用于人类精子 DNA 的研 ［7 ］ ， 究 在家畜尤其是绵羊精子 DNA 链完整性的研究 中鲜有报道。试验采用 TUNEL 法研究低温保存对小 尾寒羊精子 DNA 链完整性的影响， 以期为绵羊低温 保存精液在生产中的应用提供参考 。 1 材料 1． 1 主要试剂 三羟甲基氨基甲烷 （ Tris ） 、D － （ + ） － 葡萄糖、 青霉素、 链霉素， 由 Sigma 公司生产； 柠檬酸钠、 氯化 纯乙酸、 磷酸二氢钠、 磷酸氢二钠， 均为国产化学 钠、 纯； TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒， 由武汉博士德公司 生产。 1． 2 稀释液的配制 1． 2． 1 低温保存稀释液的配制 取基础液 （ 葡萄糖 3 g， 柠檬酸钠 3 g， 超纯水 100 mL， 煮沸消毒） 80 mL， 20 mL ， 、 加新鲜卵黄 青霉素 链霉素各 10 万 IU， 配制 ［1 ］ 成低温保存稀释液 。 1． 2． 2 缓冲液的配制 取磷酸氢二钠 22 g， 磷酸二 5． 5 g ， 1 000 mL ， 加纯化水定容至 配制成 氢钠 0． 01 mmol / L PBS 缓冲液 （ pH 值为 7． 0 ～ 7． 2 ） 。 取 Tris 1． 2 g， 加超纯水定容至 1 000 mL， 氯化钠 8． 5 g， 再加入纯乙酸 0． 5 mL， 配制成 0． 01 mmol / L TBS 缓 冲液（ pH 值为 7． 5 ） 。 2 方法 2． 1 精液的采集与常规品质评定 体质健康、 性欲旺盛的小尾寒羊 选取膘情中等、 种公羊 1 只， 用假阴道法采集精液。 精液采出后， 立
冰， 刘黎明， 王佳鹏
文章编号： 1004 － 7034 （ 2012 ） 04 － 0056 － 03
（ 赤峰学院 生命科学学院， 内蒙古 赤峰 024000 ）
关键词：低温保存； 绵羊精子； DNA 链； 原位缺口末端标记（ TUNEL） 法 摘 要：为了探讨低温保存对绵羊精子 DNA 链完整性的影响， 采用原位缺口末端标记 （ TUNEL ） 法对 48 h、 72 h、 96 h 处理的低 小尾寒羊新鲜和低温保存精子的 DNA 链完整性进行检测。结果表明： 经 24 h、 （ 0． 028 0 ± 0． 0142） ， （ 0． 037 3 ± 温保存绵羊精液的 DNA 链断裂精子百分率分别为（ 0． 017 2 ± 0． 006 2） ， 0． 017 0 ） ， （ 0． 037 1 ± 0． 008 8 ） 。与新鲜精液相比， 低温保存的精液中 DNA 链断裂精子百分率虽然略 有增加但无统计学差异， 表明低温保存对绵羊精子 DNA 链的完整性没有显著性损伤。 家畜精液的保存技术是 20 世纪随着人工授精技 术广泛应用而产生的， 其目的是为了延长精子的存活 时间及维持其受精能力， 便于长途运输， 扩大精液的 ， ， 使用范围 提高公畜的配种效率 对充分发挥良种公 畜的遗传潜力、 加快畜群品种改良步伐、 濒危物种保 ［1 ］ 存、 动物基因研究均具有十分重要的意义 。 目前， 冷冻保存是常用的精子保存方法 ， 但该方法需要长期 ， 使用液氮和低温保存设备 这在一些地区是难以实现 的， 而且运输困难。 低温保存是将稀释后的精液在 4 ℃ 的低温环境中保存几天或十几天， 不需要液氮和 低温装置， 便于运输， 近年来已成为精液保存研究的 ［2 ］ 新热点 。而提高保存精液的品质和受精能力是精 液低温保存技术的关键。目前， 精液品质的主要检测 指标有精子活率、 精液量、 精液颜色、 精子密度、 精子 畸形率、 顶体完整率、 存活时间、 气味等。一些研究发 现， 这些指标与受孕率的关系并不密切， 冷冻或低温 造成的精子结构和功能的变化才是导致受孕率降低 的根本原因。哺乳动物精子形态在不同物种间有差 异， 但是有共同的结构特征， 即主要由头部、 颈部和尾 部组成。精子形态的差异主要在头部， 由 DNA 和核 ［3 ］ 蛋白组成 ， 其中 DNA 是主要的遗传物质， 它通过半 保留复 制 将 自 己 优 质 的 基 因 传 递 给 下 一 代， 所以 DNA 链的完整性对于正常胚胎的形成非常关键。 因 此， 对精子 DNA 链的完整性进行检测具有重要意义 。 近年来， 精子 DNA 链完整性一直是生殖学领域 研究的热点之一， 随着技术的进步和研究的深入， 精 ［4 － 5 ］ DNA 。 子 链完整性的检测方法逐渐增多 目前， 原位缺口末端标记（ TUNEL ） 法是原位检测细胞凋亡
完整性无显著影响。 4 讨论 DNA 链的完整性对于正常胚胎的形成非 常 关 所以阐述低温保存精子 DNA 链的完整性对于评 键， 价精 液 品 质 有 重 要 意 义。 研 究 表 明， 精子细胞核 ［8 ］ DNA 的损伤是由于凋亡异常引起的 。 凋亡细胞单 个散在分布， 早期形态学改变为染色质固缩， 常聚集 呈境界分明的颗粒块状或新月形小体， 细胞 于核膜， 质浓缩。细胞核和细胞外形褶皱， 核裂解成质膜包绕 的碎片， 细胞突出形成质膜小泡， 脱落后形成凋亡小 体， 其内可保持完整的细胞器和致密的染色质 。在分 细胞 DNA 片段在内源性核酸内切酶的激 子水平上， ［9 ］ 活下被切割成许多短的片段 。TUNEL 法是采用非 同位素法检测细胞在凋亡过程中 DNA 链的断裂情 况， 在原位快速准确地检测单个凋亡细胞 。其原理是 当细胞凋亡发生时， 内源性核酸酶被激活， 使 DNA 的 双链断裂或 1 条链出现缺口， 产生一系列 3' － OH 末 端。在 TDT 作用下， 组织细胞原位 DNA 切口可被标 — —尿 苷 三 磷 酸 （ dUTP ） ， dUTP 结 合 在 记上生物 素— DNA 断点部位， 可以通过生物标记的抗地高辛抗体 反应后， 再结合 SABC ， 然后加入显色底物 DAB 。 凋 从而可以在显微镜下观察到着 亡的细胞核呈棕黄色， 色的凋亡细胞。试验采用 TUNEL 法对低温保存小尾 寒羊精子的 DNA 损伤情况进行检测， 试验结果表明， 新鲜与低温保存精子的 DNA 链断裂率没有显著差 异， 说明低温保存不会对绵羊精子 DNA 链完整性造 ［10 － 12 ］ 。 成显著损伤， 这与许多学者的研究结果一致 ， 试验中 低温保存小尾寒羊精子的活率随时间的 延长呈极显著下降， 但其 DNA 链断裂率与鲜精相比 虽略有增加但无显著差异， 提示绵羊精子具有较好的 抗低温打击能力， 有望在生产中应用。 ： 参考文献
表1
项目 精子活率 DNA 链断裂率
2012 年 4 月（ 上） 57
低温保存对绵羊精子活率和 DNA 链完整性的影响
0h 试验次数 A 5 0．802 ±0．002 5
a
24 h 0．748 ±0．014
a B
48 h 0．648 ±0．026
a C
72 h 0．544 ±0．051
a D
96 h 0．452 E ±0．043
0．012 6 ±0．006 0 0．017 2 ±0．006 2 0．028 0 ±0．014 2 0．037 3 ±0．017 0 0．037 1 a ±0．008 8
注： 同行数据肩标大写字母不同表示差异极显著 （ P ＜ 0． 01 ） ， 小 写字母相同表示差异不显著（ P ＞ 0． 05 ） 。
《黑龙江畜牧兽医》 科技版 即在 37 ℃ 条件下进行常规品质评定， 选择原精液密 “密” 级、 精子活力在 0． 8 以上、 无异常气味、 度达到 色泽为乳白色、 精子形态正常的用于试验。 2． 2 精液的稀释与低温保存 将符合要求的新鲜精液 在精液常规检查完成后， 按 3 ～ 6 倍的比例， 在 35 ℃ 条件下用保存稀释液进行 混匀后裹 8 ～ 10 层纱布， 置于 4 ℃ 一次性等温稀释， 冰箱中 保 存。 每 隔 24 h 检 查 精 子 活 率 1 次， 测定 DNA 链的完整性， 0． 3 。 至精子活率低于 为止 2． 3 精子活率评定 取 中 层 精 液 10 μL 滴 于 将稀 释 精 液 摇 匀 后， 37 ℃ 恒温板上等温预热的载玻片上， 盖片后置于配 37 ℃ （ 400 有 恒温台的显微镜下 倍） ， 检查精子 300 个以上， 分别计算 呈 直 线 运 动 精 子 数 和 总 精 子 数， 计算精子活率。 2． 4 精子 DNA 链完整性的检测（ TUNEL 法） 取新鲜或低温保存的绵羊精液制作涂片 ， 充分晾 干后， 立即用 4% 多聚甲醛（ 用 0． 01 mol / L PBS 配制） PBS 液洗涤 （ 2 min × 2 次 ） ， 室温固定 60 min， 纯化水 洗涤（ 2 min × 2 次 ） 。 用新鲜配制的 3% H2 O2 室温 纯化水洗涤 （ 2 min × 3 次 ） 。 标本片加 处理 10 min， TBS 洗涤（ 2 min × 新鲜稀释液于 37 ℃ 消化 30 ～ 40 s， 2 次） 。 标本片加标记液［ 脱氧核糖核苷酸末端转移酶 （ TDT ） 和 标 记 的 脱 氧 核 苷 酸 （ DIG － d － UTP ） 各 1 μL， 37 ℃ 加入 18 μL 标记缓冲液中］ 置于湿盒中， TBS 洗 涤 （ 2 min × 2 次 ） 。 加 封 闭 液， 标记 2 h， 50 μL / 片， 室温放置 30 min， 甩掉封闭液， 不洗。用抗 （ 1 mL 抗体稀 体稀释液稀释生物素化抗地高辛抗体 释液加生物素化抗地高辛抗体 10 μL ） ， 按 50 μL / 片 37 ℃ 反应 30 min， TBS 洗 加至标本片， 置于湿盒中， 涤（ 2 min × 2 次） 。 用抗体稀释液稀释链霉亲和素 － 1 mL 抗 体 稀 释 液 加 SABC 过 氧 化 物 酶 （ SABC ， 10 μL） ， 37 ℃ 反应 30 min， 按 50 μL / 片处理标本片， TBS 洗涤（ 5 min × 2 次 ） 。 使用二氨基联苯胺 （ DAB ， 1 mL 纯化水， A， B， C 试剂 分别加入 DAB 试剂盒中， PBS 洗涤 （ 5 min × 4 次 ） 。 DAB 各 1 滴） 显色 20 min， 染色后光镜镜检 （ 400 × ） ， 精子头部无染色为阴性， 表明 DNA 链无断裂； 精子头部呈棕黄色为阳性， 表 明 DNA 链断裂。每份样品计数 300 个以上精子， 计 算 DNA 链断裂精子百分率。 2． 5 数据处理 试验数据采用 Excel 软件中数据分析工具库进 t 检验和方差分析。试验重复 5 次以上。 行描述统计、 3 结果（ 见表 1 ） 与分析 由表 1 可知： 随着低温保存时间的延长， 精子活 率呈逐渐下降趋势， 且差异极显著 （ P ＜ 0． 01 ） ， 而精 DNA ， 子 链断裂率与鲜精相比虽有所增加 但差异不 显著（ P ＞ 0． 05 ） ， 表明低温保存对绵羊精子 DNA 链
56
Heilongjiang Animal Science and Veterinary Medicine
№ 4 2012
低温保存对绵羊精子 DNA 链完整性的影响
徐振军， 张红霞，wenku.baidu.com刘
中图分类号： S826 文献标识码： B
收稿日期：2011 － 07 － 15 ；修回日期：2011 － 07 － 29 基金项目：内蒙古自治区高校科研项目（ NJ09170 ） linkur3@ 126． com． 作者简介：徐振军（ 1965 － ） ， 男， 教授， 硕士，
最敏感、 快速、 特异的新方法， 具有广泛的应用前景。 TUNEL 法是指脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺 将分子生物学方法与形态学方法相结 口末端标记法， ， 合 用来对完整的凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染 能准确地反映细胞凋亡最典型的形态学及生物化 色， ［6 ］ 学特征 。目前， 此方法多用于人类精子 DNA 的研 ［7 ］ ， 究 在家畜尤其是绵羊精子 DNA 链完整性的研究 中鲜有报道。试验采用 TUNEL 法研究低温保存对小 尾寒羊精子 DNA 链完整性的影响， 以期为绵羊低温 保存精液在生产中的应用提供参考 。 1 材料 1． 1 主要试剂 三羟甲基氨基甲烷 （ Tris ） 、D － （ + ） － 葡萄糖、 青霉素、 链霉素， 由 Sigma 公司生产； 柠檬酸钠、 氯化 纯乙酸、 磷酸二氢钠、 磷酸氢二钠， 均为国产化学 钠、 纯； TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒， 由武汉博士德公司 生产。 1． 2 稀释液的配制 1． 2． 1 低温保存稀释液的配制 取基础液 （ 葡萄糖 3 g， 柠檬酸钠 3 g， 超纯水 100 mL， 煮沸消毒） 80 mL， 20 mL ， 、 加新鲜卵黄 青霉素 链霉素各 10 万 IU， 配制 ［1 ］ 成低温保存稀释液 。 1． 2． 2 缓冲液的配制 取磷酸氢二钠 22 g， 磷酸二 5． 5 g ， 1 000 mL ， 加纯化水定容至 配制成 氢钠 0． 01 mmol / L PBS 缓冲液 （ pH 值为 7． 0 ～ 7． 2 ） 。 取 Tris 1． 2 g， 加超纯水定容至 1 000 mL， 氯化钠 8． 5 g， 再加入纯乙酸 0． 5 mL， 配制成 0． 01 mmol / L TBS 缓 冲液（ pH 值为 7． 5 ） 。 2 方法 2． 1 精液的采集与常规品质评定 体质健康、 性欲旺盛的小尾寒羊 选取膘情中等、 种公羊 1 只， 用假阴道法采集精液。 精液采出后， 立
冰， 刘黎明， 王佳鹏
文章编号： 1004 － 7034 （ 2012 ） 04 － 0056 － 03
（ 赤峰学院 生命科学学院， 内蒙古 赤峰 024000 ）
关键词：低温保存； 绵羊精子； DNA 链； 原位缺口末端标记（ TUNEL） 法 摘 要：为了探讨低温保存对绵羊精子 DNA 链完整性的影响， 采用原位缺口末端标记 （ TUNEL ） 法对 48 h、 72 h、 96 h 处理的低 小尾寒羊新鲜和低温保存精子的 DNA 链完整性进行检测。结果表明： 经 24 h、 （ 0． 028 0 ± 0． 0142） ， （ 0． 037 3 ± 温保存绵羊精液的 DNA 链断裂精子百分率分别为（ 0． 017 2 ± 0． 006 2） ， 0． 017 0 ） ， （ 0． 037 1 ± 0． 008 8 ） 。与新鲜精液相比， 低温保存的精液中 DNA 链断裂精子百分率虽然略 有增加但无统计学差异， 表明低温保存对绵羊精子 DNA 链的完整性没有显著性损伤。 家畜精液的保存技术是 20 世纪随着人工授精技 术广泛应用而产生的， 其目的是为了延长精子的存活 时间及维持其受精能力， 便于长途运输， 扩大精液的 ， ， 使用范围 提高公畜的配种效率 对充分发挥良种公 畜的遗传潜力、 加快畜群品种改良步伐、 濒危物种保 ［1 ］ 存、 动物基因研究均具有十分重要的意义 。 目前， 冷冻保存是常用的精子保存方法 ， 但该方法需要长期 ， 使用液氮和低温保存设备 这在一些地区是难以实现 的， 而且运输困难。 低温保存是将稀释后的精液在 4 ℃ 的低温环境中保存几天或十几天， 不需要液氮和 低温装置， 便于运输， 近年来已成为精液保存研究的 ［2 ］ 新热点 。而提高保存精液的品质和受精能力是精 液低温保存技术的关键。目前， 精液品质的主要检测 指标有精子活率、 精液量、 精液颜色、 精子密度、 精子 畸形率、 顶体完整率、 存活时间、 气味等。一些研究发 现， 这些指标与受孕率的关系并不密切， 冷冻或低温 造成的精子结构和功能的变化才是导致受孕率降低 的根本原因。哺乳动物精子形态在不同物种间有差 异， 但是有共同的结构特征， 即主要由头部、 颈部和尾 部组成。精子形态的差异主要在头部， 由 DNA 和核 ［3 ］ 蛋白组成 ， 其中 DNA 是主要的遗传物质， 它通过半 保留复 制 将 自 己 优 质 的 基 因 传 递 给 下 一 代， 所以 DNA 链的完整性对于正常胚胎的形成非常关键。 因 此， 对精子 DNA 链的完整性进行检测具有重要意义 。 近年来， 精子 DNA 链完整性一直是生殖学领域 研究的热点之一， 随着技术的进步和研究的深入， 精 ［4 － 5 ］ DNA 。 子 链完整性的检测方法逐渐增多 目前， 原位缺口末端标记（ TUNEL ） 法是原位检测细胞凋亡
完整性无显著影响。 4 讨论 DNA 链的完整性对于正常胚胎的形成非 常 关 所以阐述低温保存精子 DNA 链的完整性对于评 键， 价精 液 品 质 有 重 要 意 义。 研 究 表 明， 精子细胞核 ［8 ］ DNA 的损伤是由于凋亡异常引起的 。 凋亡细胞单 个散在分布， 早期形态学改变为染色质固缩， 常聚集 呈境界分明的颗粒块状或新月形小体， 细胞 于核膜， 质浓缩。细胞核和细胞外形褶皱， 核裂解成质膜包绕 的碎片， 细胞突出形成质膜小泡， 脱落后形成凋亡小 体， 其内可保持完整的细胞器和致密的染色质 。在分 细胞 DNA 片段在内源性核酸内切酶的激 子水平上， ［9 ］ 活下被切割成许多短的片段 。TUNEL 法是采用非 同位素法检测细胞在凋亡过程中 DNA 链的断裂情 况， 在原位快速准确地检测单个凋亡细胞 。其原理是 当细胞凋亡发生时， 内源性核酸酶被激活， 使 DNA 的 双链断裂或 1 条链出现缺口， 产生一系列 3' － OH 末 端。在 TDT 作用下， 组织细胞原位 DNA 切口可被标 — —尿 苷 三 磷 酸 （ dUTP ） ， dUTP 结 合 在 记上生物 素— DNA 断点部位， 可以通过生物标记的抗地高辛抗体 反应后， 再结合 SABC ， 然后加入显色底物 DAB 。 凋 从而可以在显微镜下观察到着 亡的细胞核呈棕黄色， 色的凋亡细胞。试验采用 TUNEL 法对低温保存小尾 寒羊精子的 DNA 损伤情况进行检测， 试验结果表明， 新鲜与低温保存精子的 DNA 链断裂率没有显著差 异， 说明低温保存不会对绵羊精子 DNA 链完整性造 ［10 － 12 ］ 。 成显著损伤， 这与许多学者的研究结果一致 ， 试验中 低温保存小尾寒羊精子的活率随时间的 延长呈极显著下降， 但其 DNA 链断裂率与鲜精相比 虽略有增加但无显著差异， 提示绵羊精子具有较好的 抗低温打击能力， 有望在生产中应用。 ： 参考文献
表1
项目 精子活率 DNA 链断裂率
2012 年 4 月（ 上） 57
低温保存对绵羊精子活率和 DNA 链完整性的影响
0h 试验次数 A 5 0．802 ±0．002 5
a
24 h 0．748 ±0．014
a B
48 h 0．648 ±0．026
a C
72 h 0．544 ±0．051
a D
96 h 0．452 E ±0．043
0．012 6 ±0．006 0 0．017 2 ±0．006 2 0．028 0 ±0．014 2 0．037 3 ±0．017 0 0．037 1 a ±0．008 8
注： 同行数据肩标大写字母不同表示差异极显著 （ P ＜ 0． 01 ） ， 小 写字母相同表示差异不显著（ P ＞ 0． 05 ） 。
《黑龙江畜牧兽医》 科技版 即在 37 ℃ 条件下进行常规品质评定， 选择原精液密 “密” 级、 精子活力在 0． 8 以上、 无异常气味、 度达到 色泽为乳白色、 精子形态正常的用于试验。 2． 2 精液的稀释与低温保存 将符合要求的新鲜精液 在精液常规检查完成后， 按 3 ～ 6 倍的比例， 在 35 ℃ 条件下用保存稀释液进行 混匀后裹 8 ～ 10 层纱布， 置于 4 ℃ 一次性等温稀释， 冰箱中 保 存。 每 隔 24 h 检 查 精 子 活 率 1 次， 测定 DNA 链的完整性， 0． 3 。 至精子活率低于 为止 2． 3 精子活率评定 取 中 层 精 液 10 μL 滴 于 将稀 释 精 液 摇 匀 后， 37 ℃ 恒温板上等温预热的载玻片上， 盖片后置于配 37 ℃ （ 400 有 恒温台的显微镜下 倍） ， 检查精子 300 个以上， 分别计算 呈 直 线 运 动 精 子 数 和 总 精 子 数， 计算精子活率。 2． 4 精子 DNA 链完整性的检测（ TUNEL 法） 取新鲜或低温保存的绵羊精液制作涂片 ， 充分晾 干后， 立即用 4% 多聚甲醛（ 用 0． 01 mol / L PBS 配制） PBS 液洗涤 （ 2 min × 2 次 ） ， 室温固定 60 min， 纯化水 洗涤（ 2 min × 2 次 ） 。 用新鲜配制的 3% H2 O2 室温 纯化水洗涤 （ 2 min × 3 次 ） 。 标本片加 处理 10 min， TBS 洗涤（ 2 min × 新鲜稀释液于 37 ℃ 消化 30 ～ 40 s， 2 次） 。 标本片加标记液［ 脱氧核糖核苷酸末端转移酶 （ TDT ） 和 标 记 的 脱 氧 核 苷 酸 （ DIG － d － UTP ） 各 1 μL， 37 ℃ 加入 18 μL 标记缓冲液中］ 置于湿盒中， TBS 洗 涤 （ 2 min × 2 次 ） 。 加 封 闭 液， 标记 2 h， 50 μL / 片， 室温放置 30 min， 甩掉封闭液， 不洗。用抗 （ 1 mL 抗体稀 体稀释液稀释生物素化抗地高辛抗体 释液加生物素化抗地高辛抗体 10 μL ） ， 按 50 μL / 片 37 ℃ 反应 30 min， TBS 洗 加至标本片， 置于湿盒中， 涤（ 2 min × 2 次） 。 用抗体稀释液稀释链霉亲和素 － 1 mL 抗 体 稀 释 液 加 SABC 过 氧 化 物 酶 （ SABC ， 10 μL） ， 37 ℃ 反应 30 min， 按 50 μL / 片处理标本片， TBS 洗涤（ 5 min × 2 次 ） 。 使用二氨基联苯胺 （ DAB ， 1 mL 纯化水， A， B， C 试剂 分别加入 DAB 试剂盒中， PBS 洗涤 （ 5 min × 4 次 ） 。 DAB 各 1 滴） 显色 20 min， 染色后光镜镜检 （ 400 × ） ， 精子头部无染色为阴性， 表明 DNA 链无断裂； 精子头部呈棕黄色为阳性， 表 明 DNA 链断裂。每份样品计数 300 个以上精子， 计 算 DNA 链断裂精子百分率。 2． 5 数据处理 试验数据采用 Excel 软件中数据分析工具库进 t 检验和方差分析。试验重复 5 次以上。 行描述统计、 3 结果（ 见表 1 ） 与分析 由表 1 可知： 随着低温保存时间的延长， 精子活 率呈逐渐下降趋势， 且差异极显著 （ P ＜ 0． 01 ） ， 而精 DNA ， 子 链断裂率与鲜精相比虽有所增加 但差异不 显著（ P ＞ 0． 05 ） ， 表明低温保存对绵羊精子 DNA 链