生化实验

本方法是半微量定糖法，操作简便，快速，杂质干扰较少。
实验器材
试管和试管架 铁架台 碱滴定管（50ml） 滴定管夹
吸量管（1ml和2ml）
水浴锅 三脚架 白瓷板
容量瓶（100ml）
玻璃漏斗和烧杯。 量筒 玻璃棒
电子天平
恒温水浴
762 分光光度计
756 分光光度计
实验试剂
3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂：称取6.5g DNS溶于少量热蒸 馏水中，溶解后移入1000ml容量瓶中，加入2mol/L氢氧化钠溶 液325ml，再加入45g丙三醇，摇匀，冷却后定容至1000ml。 葡萄糖标准溶液：准确称取干燥恒重的葡萄糖 200mg，加少量
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仪器及耗材：
紫外分光光度计，石英比色皿，离心管。
试剂：
动、植物基因组DNA（RNA）或大肠杆菌
质粒DNA（RNA），待测样品DNA
（RNA），TE或蒸馏水。
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操作步骤:
（1）用TE或蒸馏水，将待测样品以1:10或更高倍数稀释。
（2）取2只石英比色杯，加蒸馏水至2/3，在260nm下调零。
各5ml
摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595nm处比色
二、未知样品蛋白质浓度测定 制备待测样品：称取新鲜绿豆芽 2g 放入研钵，加 2mL 蒸馏水研磨成匀浆，转移到离心管中，再用 3mL 蒸馏水分次洗涤研钵，洗涤液收集于同一离心 管，5000r/min 离心10min，取上清液转入10mL 容 量瓶，并以蒸馏水定容至刻度，即得待测样品。
曲线。如果该直线不通过零点，必须重做。
（二）还原糖的制备
1. 称取2g玉米粉，把它放入一个100ml的烧杯中，然后加入 50~60ml蒸馏水，搅拌均匀。
2. 把烧杯放于一个50℃水浴中保温 30 min，不时搅拌。
3. 拿出烧杯，将烧杯内含物转入100ml的容量瓶中定溶，充分 混合，过滤，滤出液即为还原糖提取液。
8、实验过程要正规操作，动手、动脑主动进行实验；掌握关 键，力求得出准确结果；仔细观察，认真思考，及时做好记 录；综合分析得出正确的实验结论。
9、因故不能按时上实验者应有请假手续。
10、实验结束后将相关器材要彻底清洗干净，放到指定位臵。 11、废弃物严格按要求分类收集、处理。 12、值日生要按规定要求将实验室打扫干净，检查门窗、水、 电、煤气等。
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二、实验要求
1、课前必须预习，写好预习报告。
2、了解实验的基本原理和主要步骤，做到心中有数。
3、上实验课必须穿实验服，带实验讲义。 4、不许大声喧哗，有问题及时请教老师。 5、器材、药品等严格按规定使用，严禁乱用乱放。 6、实验过程中因个人未能按着实验要求操作而导致器材 的损坏，按规章制度进行赔偿。 7、遵守实验制度，爱护仪器，注意安全（如，水、电、 煤气、强酸、强碱等）。 生物科学与工程系生物化学教研室
—— 与斐林、土伦、本氏试剂呈正反应的糖
非还原性糖（Nonreducing sugar）
——无变旋、还原、成脎性质
在NaOH和丙三醇存在下，3,5-二硝基水杨酸（DNS）与还原糖
共热后被还原生成氨基化合物。在过量的NaOH碱性溶液中此
化合物呈桔红色，在540nm波长处有最大吸收，在一定的浓度 范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测 定样品中的含糖量。
蒸馏水溶解后，再定容至100ml，即含葡萄糖为2.0mg/ml。
6mol/L HCl：取250ml浓HCl(35~38%) 蒸馏水稀释到500ml。 碘-碘化钾溶液：称取5g碘，10g碘化钾溶于100ml蒸馏水中。
6N NaOH：称120g NaOH溶于500ml蒸馏水中。
0.1% 酚酞指示剂。
实验材料 ：玉米淀粉
各5ml
摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595nm处比色
实验操作 一、制定标准曲线——高浓度标准曲线
操作步骤同上 试管编号 1mg/ml标准蛋白溶液(ml) 蒸馏水(ml) 考马斯亮蓝试剂(ml) OD595nm 0 0.0 1.0 1 0.2 0.8 2 0.4 0.6 3 0.6 0.4 4 0.8 0.2 5 1.0 0.0
(三) 样品总糖的水解和提取
1. 取1g玉米粉，放在100ml烧杯中，加15ml水溶解，再加10ml
6mol/L 盐酸，混匀。 2. 将烧杯置于沸水浴中加热煮沸30 min。 3.取出 1~2 滴置于白瓷板上，加 1 滴 I-KI 溶液检查水解是否完全。 如已水解完全，则不呈现蓝色。
降，应设法去除。
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思考题：
1．采用紫外光吸收法测定样品的核酸含量，有何优点及缺点？
2．若样品中含有核苷酸类杂质，应如何校正？
3. 地衣酚显色法（RNA）和二苯胺显色法的缺点是什么？
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实验二
蛋白质的比色定量分析
——考马斯亮蓝法
实验目的
熟悉分光光度计的基本原理和使用方法 掌握利用考马斯亮蓝定量分析蛋白质的方法
生 物 化 学 实 验
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一、实验课的目的
1、培养和锻炼科学的思维方法、实事求是的科学态度 和严格的科学作风，提高分析、解决问题的能力。
2、通过实验加深对理论课程的理解，学习掌握基本的 生物化学实验技能与实验方法，为今后的学习和研 究打下一定基础。
3、培养爱护公物、爱护集体、团结互助的优良品德。
（3）取出比色槽外侧的比色杯，去掉蒸馏水，加待测样品 DNA，在260nm、280nm及310nm处读取OD值。 （4）小心取出比色杯，用蒸馏水清洗，将水吸干，放入比色 杯盒内。
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（5）计算浓度：
纯DNA或RNA浓度可用下列公式计算： [dSDNA]=50×(OD260-OD310)× 稀释倍数（g /ml） [SSDNA]=33×(OD260-OD310)×稀释倍数（g /ml） [SSRNA]=40×(OD260-OD310)× 稀释倍数（g /ml）
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注意事项：
1. OD310值是背景，若盐浓度高， OD310值也高。
2. OD260/OD280 对DNA而言其值约为1.8，高于1.8 可能有 RNA污染，低于1.8 可能有蛋白质污染。
3. OD260/OD280 对RNA而言其值约为2.0
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测定：取2 支10mL 试管，按下表取样。 管 号
待测样品提取液（ml）
1
2ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
0.1
0.9 5
0.1
0.9 5
蒸馏水（ml）
考马斯亮蓝G-250试剂（ml） OD595nm 蛋白质含量（g ）
计算结果
X：为在标准曲线上查德的蛋白质含量（ g ）
注意事项
测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯 壁上，实验证明此复合物的吸附量可以忽略。测定结束 后，可用乙醇将比色杯壁上的蓝色洗干净。
常灵敏，可测微克(g)级蛋白质含量，所以是一种常用的蛋白质
快速测定法。
实验器材
（1）分析天平、台式天平 （2）刻度吸管 （3）试管、试管架 （4）研钵 （5）离心机、离心管
（6）烧杯、量筒
（7）微量取样器 （8）分光光度计 762分光光度计
Coomassie brilliant blue G-250
实验操作：
（一）葡萄糖标准曲线制作 1. 取6支试管，按下表加入2.0mg/ml葡萄糖标准液和蒸馏水 管号 0 1 2 3 4 5 葡萄糖标准液 蒸馏水 DNS 最终浓度 OD540nm （ml） （ml） （ml） （mg/ml） 0.0 1.0 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 2 ? ? ? ? ?
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三、实验内容
实验一、核酸的比色定量分析——紫外分光光度法 实验二、蛋白质的比色定量分析—— 考马斯亮蓝法 实验三、3, 5 - 二硝基水杨酸法测定总糖和还原糖 实验四、血清蛋白的醋酸纤维素薄膜电泳 实验五、用纸层析法鉴定转氨酶的转氨基作用 实验六、猪肝（小牛肠）碱性磷酸酶的提纯及比活力测定 实验七、 DEAE纤维素离子交换层析法分离血清蛋白 实验八、蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量 实验九、酶联免疫吸附试验
实验操作 一、制定标准曲线——低浓度标准曲线
取6支10ml干净试管 按下表取样，混匀，放置2min。在595nm 下比色，纪录数据。以OD值为纵坐标、标准蛋白含量为横坐标 作图，得到标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的 OD值，即可查出未知样品的蛋白含量。 试管编号 0 1 0.02 0.98 2 0.04 0.96 3 4 5 1mg/ml标准蛋白溶液(ml) 0.00 0.10 蒸馏水(ml) 考马斯亮蓝试剂(ml) OD595nm 0.06 0.08 0.10 0.94 0.92 0.90
主要试剂
1、生理盐水：称0.9g NaCl，用蒸馏水定溶至100mL。 2、蛋白质标准液（250g/ml）：称小牛血清白蛋白25mg，用蒸 馏水定溶至100mL。 3、蛋白质标准液（500g/ml）：称小牛血清白蛋白50mg，用蒸 馏水定溶至100mL。 4、考马斯亮蓝G-250溶液：称100mg考马斯亮蓝G-250，加95% 乙醇50mL，加85%（W/V）H3PO4 100mL，用蒸馏水定溶至 1000mL，置棕色瓶过夜，再用二层滤纸过滤。最终试剂中含 0.01%(W/V)考马斯亮蓝G-250，4.7%(W/V)乙醇。
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实验一 核酸的比色定量分析 ——紫外分光光度法
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实验目的：
掌握紫外分光光度计的基本原理和使用方法 掌握紫外分光光度法测定核酸含量的原理和操作方法
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实验原理：
DNA 或 RNA分子在 260nm 处有特异的紫外吸收峰，其吸收 强度与 DNA 或 RNA的浓度成正比。核酸分子的形状，双链和单 链之间的转换，也会导致吸收水平的改变，但是这种偏差可以用 特定的公式来校正。该法的特点是准确、简便。
地衣酚显色法（RNA） ：在三氯化铁及盐酸存在下，RNA与3,5-二羟基甲苯 （地衣酚）反应，生成绿色物质，其最大光吸收值在 670nm处。地衣酚反应 特异性较差，戊糖均可与地衣酚反应，DNA及其他杂质也能给出类似颜色。 二苯胺显色法 ：DNA在酸性条件下加热，其嘌呤碱与脱氧核糖间的糖苷键断 裂，生成嘌呤碱、脱氧核糖和脱氧嘧啶核苷酸，而2-脱氧核糖在酸性环境中 加热脱水生成 ω - 羟基 - γ - 酮基戊糖，与二苯胺试剂反应生成蓝色物质，在 595nm波长处有最大吸收。
思考题
1.考马斯亮蓝 G-250 法测定蛋自质含量的原理是什么？ 还有哪些蛋自质定量法？ 2.考马斯亮蓝法测定蛋自质含量时，应该注意些什么？
实验三
3, 5 - 二硝基水杨酸(DNS)法
测定总糖和还原糖
实验目的
掌握利用分光光度计测定还原糖的原理和方法
实验原理
还原糖与非还原糖
还原性糖（Reducing sugar）
2. 向各试管中分别加入DNS试剂2.0 ml，充分混合，放入沸水
浴中加热煮沸2 min进行显色，取出试管放入盛有冷水的烧杯
中迅速冷却。 3.向各管中分别加入4ml蒸馏水，充分混合。 4.以空白管（0号管）做对照，于540nm 波长下调0，然后测 定各管的OD 值。
5. 以光吸收值作为纵坐标，葡萄糖含量为横坐标，绘制标准
纯度分析
蛋白质和核苷酸等也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸
收高峰在 280nm 波长处，在 260nm 处的吸收值仅为核酸的
1/10或更低，因此对于含有微量蛋白质的核酸样品，测定误 差较小， RNA 的 260nm 与 280nm 吸收的比值在 2.0 以上； DNA的260nm与280nm吸收的比值则在1.8左右。 当样品中含有蛋白质、苯酚等杂质，则A260/A280比值下
实验原理
考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。 考马斯亮蓝G-250在游离状态呈红褐色，当它与蛋白质结合后变
为蓝色，前者最大吸收波长为488nm，后者为595nm。在一定蛋
白浓度范围内（0.01~1.0mg/ml），蛋白质-色素结合物在595nm 波长下的光吸收与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量 分析。蛋白质和考马斯亮蓝G-250结合2min左右达到平衡，完全 反应十分迅速，其结合物在室温下1小时内保持稳定。该反应非