超薄切片技术
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40-60min
2.原位包埋法
适用于组织块中数量少的特殊结构， 如：运动终板；冷冻切片、半薄切片及 单层培养细胞的某些结构的观察. 1、组织块：前固定后用振动切片机切成 50-100μ m的厚片，显微镜下选出含有所 需结构的厚片进行漂洗。经过1%锇酸后 固定，乙醇及丙酮系列脱水，环氧树脂 浸透，把厚片铺于载玻片上，将顶端平 整的废包埋块安在切片的特定部位上， 60 ℃聚合后修块，常规切片及染色。
四.浸透及包埋
浸透：目的是使包埋剂逐渐取代脱水剂
渗透到组织细胞中。因包埋剂与脱水剂不 相溶，需用一种既能与脱水剂相溶，又能 与包埋剂相溶的物质进行转换，常用的转 换剂为环氧丙烷。
包埋：目的是让包埋剂完全浸透到组织
细胞内部，使组织具有一定的硬度、弹性 和韧性，能够承受切片时的各种压力，以 便制备超薄切片.
浸泡固定法
是将所取样品直接放入预冷固定液内固定
的方法，适用于大多数组织器官。最常用的
是戊二醛、锇酸双重固定。
操作步骤:
前固定： 2.5%-4%戊二醛 后固定：1%锇酸 4℃ 4℃ 1-2h或数月 2-4h 中间换3次 30min） 漂洗：用配固定液的缓冲液 4℃
1.5-2h（培养细胞
漂洗：
蒸百度文库水
4℃
常用的包埋剂
环氧树脂 –Epon812(进口) 渗入组织容易，对细 胞结构保存好，较常用 –618(国产) 低粘度包埋剂(Spurr) 组织结构保存好， 切片透明度高，电子束照射时稳定性好。 多用于能谱分析的样品包埋。 丙烯酸酯（acrylic resin) 具有低黏度、 亲和性强和优良的切割性能，并能耐受电 子束的轰击及在低温下聚合的特点。包括： LowcrylK4M、K11M、HM20、HM23
常用固定剂
戊二醛(Glutaraldehyde，GA)
–无色透明液体， pH4±，使用浓度为 2.5 ～ 4 ％，使用温度4℃。 – 优点
• 穿透能力强 • 能较好地保存蛋白质、碳水化合物的结构及酶的 活性 • 固定时间长(4℃可达数周至数月)
–
缺点
• 组织反差不好 • 对脂类无固定作用 • 固定后标本要充分冲洗
主要步骤
取材 固定 脱水 浸透及包埋 切片 染色
一.取材
从人体、动植物、细胞和微生物的培养物
中选取电镜观察材料的过程。 在活体取材时要做到： •快─离体1～2min内放入固定液 •准─取材部位要准，有代表性 •小─1mm×1mm×1mm大小，太小时结 构少，太大时固定不充分结构保存不 好 •轻─动作要轻，器械要锋利 •冷─0℃ ～ 4℃ ，器械、容器、固 定液均需预冷
五.切片
目的：制备厚度小于100nm的切片
准备工作:
1.复膜载网
• 支持膜 –formvar膜 –火棉胶膜 –碳膜 用于负染技术 • 支持网 –铜网 常用 –不锈钢网、镍网、铂网（组化用）
2.制刀 3.修块 –目的是去除组织块周围多余的包 埋介质，便于切片。 半薄切片: –目的是确定所要观察的准确部位， 厚度为0.5～1μ m，用甲苯胺兰染 色显示。
10min
原位固定法
多用于解剖关系比较复杂、质地柔软或
对缺氧比较敏感的组织。以保证器官的 血液供给，避免缺血造成的组织损伤或 自溶。 操作步骤 在动物麻醉后保持血液供应的条件 下，边解剖边在取材的部位局部滴加固 定液，直至组织达到适当的硬度为宜。
灌流固定法
指通过血液循环途径，将固定液灌 注到组织器官内，进行固定后再取材的 方法。常用于对缺氧敏感，死后变化快 的组织器官，如中枢神经系统、心脏、 胃肠道、视网膜和肾脏等。也可用于所 取组织的种类较多以及解剖关系比较复 杂、难以渗透的组织器官。 包括全身灌流固定法（适用于小动物） 和器官灌流固定法（适用于大动物）。
超薄切片技术
概念: 指制备厚度低于100nm的切片技术。 特点： • 是透射电镜生物样品制备技术中最 常见、最基本的技术； • 是其他技术方法的基础； • 程序长、操作较复杂、精细。
生物医学样品的特点：
1、样品多样化，包括组织、细胞、微 生物级生物大分子。 2、含水量多、质地软、脱水时容易皱 缩变形。 3、机械程度低，对电子束轰击的耐受 力差。 4、多由低原子序数的元素组成，故导 电性能差。 5、样品形态对试剂的PH值及温度较敏 感
二.固定
目的
–尽可能保存组织和细胞在生活状态下 的结构 –使细胞内的各种成分固定下来，避免 在以后的冲洗和脱水等步骤中溶解和流 失 –防止细胞内酶活性造成的细胞自溶 –防止外界微生物侵入繁殖而产生腐败 致使细胞的超微结构遭受破坏
方法 –物理方法 •快速冷冻法 •干燥法 –化学方法 •浸泡固定法 •原位固定法 •灌流固定法
多聚甲醛(Paraformaldehyde)
白色粉末，使用浓度为4％ 优点
–对组织的浸透力强 –保存抗原性物质，多用于免疫电镜技 术中 缺点 –高浓度时可使组织结构流失，多不单 独使用
常用缓冲液
用于配制固定液和漂洗 –0.2M磷酸盐缓冲液:较常用 –0.2M二甲砷酸盐缓冲液:用于电镜细 胞化学
性差
–丙酮:可溶解脂类，与包埋剂的互溶性好，
但易使组织变脆
脱水步骤
从低浓度至高浓度系列脱水
–50% 酒精 4℃ 10～15min –70% 酒精 4℃ 10～15min或过夜 –80% 酒精 室温 10～15min –90% 酒精 室温 10～15min –95% 酒精 室温 10～15min –95%酒精：95%丙酮（1：1）室温 10～15min –95%丙酮 室温 10～15min –无水丙酮 室温 40min 中间换一次
操作步骤（以全身灌流固定法为例）
麻醉要进行灌流的动物,将动 物固定于实验台上,打开胸腔暴露 心脏,将针头刺入左心室，剪开右 心耳以引出血液和灌流液。用注射 器或输液器缓慢注入37 ℃、 0.9%NaCl,直至内脏血色消失或流 出液无血色为止,注入4 ℃固定液， 待组织变硬后取材。
三.脱
水
目的 –将组织内部游离的水分脱净，有利于 浸透和包埋 常用脱水剂 –乙醇:使组织收缩较小，但与包埋剂的互溶
锇酸(Osmium tetroxide OsＯ4)
淡黄色块状结晶，使用浓度1～4％，使
用温度4℃。
优点
–对蛋白质和脂类有较好的固定作用 –可避免组织块收缩或膨胀 –可产生明显的反差 缺点 –分子量大，穿透能力差 –对碳水化合物和酶固定效果不好 –固定时间较长易引起组织变脆 –有强烈的刺激味对角膜、鼻粘膜有毒性作用 –光热作用时易发生变化
超薄切片:采用超薄切片机 –操作步骤: •包埋块固定 •刀固定 •水槽加水 •切片 •选片 •捞片
切片的厚度可根据干涉色来判断。 –暗灰色调 40nm –灰色 40-50nm，较薄，易被电 子 束击破 –银白色 50-70nm，最常用 –金黄色 70-80nm –紫色为 90nm以上，较厚，细节结 构不清
2 、切片及单层培养细胞（需要在玻片上
进行）： 在光镜下选出所需观察的部位，在玻片 反面用笔做好标记。前固定、漂洗、后固 定，脱水及浸透同常规包埋方法，但各步 骤时间可适当缩短。在玻片有标记处的正 面位置滴上包埋剂，将顶端平整的废包埋 块压在其上，于60 ℃聚合硬化。将粘有 包埋块的玻片置于90 ℃热板上加温10s， 取下包埋块修块，超薄切片及电子染色。
六.电子染色
利用重金属盐类选择性地与生物样品 中不同结构成分相结合，来提高结构成分 散射电子的能力，从而增加图像反差的染 色，又称为正染色。 常用的染色剂: –0.5％～１％醋酸双氧铀
• 可使核酸、蛋白质、结缔组织纤维的反差增强。
–0.1％～0.4％柠檬酸铅
• 可使膜结构、脂类的反差增强。
Lowcryl K4M：
为低温水溶性包埋剂，较常用。特 点是低温下(-35 ℃)可保持低黏度；在 紫外光（波长360nm）下可聚合。聚合 后可在常温下切片；能较好地保持组织 结构和抗原性及植物凝血素结合部位， 减少背景非特异性染色，故多用于免疫 细胞化学的包埋后染色。 包埋剂配方（K4M) K4M(单体） 8.65g 交联剂 1.35g 引发剂 50mg
LR white: 为混合的丙烯酸单体，对脂 类溶解度低，保存膜结构较好， 可耐受电子束轰击，因而可不做 支持膜。热聚合60 ℃ ， 24h；冷 聚合-25 ℃ ，加速剂协助聚合。
包埋方法
1.常规包埋方法 适用于大多数组织块及细胞团
浸透 –环氧丙烷 室温 20min –环氧丙烷:包埋剂 1:1 室温 –包埋剂 室温 3h 包埋聚合 –将样品放入包埋板或胶囊内 –充填满包埋剂 –放好标签 聚合(使包埋剂变硬) –35 ℃ 12h –45 ℃ 12h –55 ℃ 12h
2.原位包埋法
适用于组织块中数量少的特殊结构， 如：运动终板；冷冻切片、半薄切片及 单层培养细胞的某些结构的观察. 1、组织块：前固定后用振动切片机切成 50-100μ m的厚片，显微镜下选出含有所 需结构的厚片进行漂洗。经过1%锇酸后 固定，乙醇及丙酮系列脱水，环氧树脂 浸透，把厚片铺于载玻片上，将顶端平 整的废包埋块安在切片的特定部位上， 60 ℃聚合后修块，常规切片及染色。
四.浸透及包埋
浸透：目的是使包埋剂逐渐取代脱水剂
渗透到组织细胞中。因包埋剂与脱水剂不 相溶，需用一种既能与脱水剂相溶，又能 与包埋剂相溶的物质进行转换，常用的转 换剂为环氧丙烷。
包埋：目的是让包埋剂完全浸透到组织
细胞内部，使组织具有一定的硬度、弹性 和韧性，能够承受切片时的各种压力，以 便制备超薄切片.
浸泡固定法
是将所取样品直接放入预冷固定液内固定
的方法，适用于大多数组织器官。最常用的
是戊二醛、锇酸双重固定。
操作步骤:
前固定： 2.5%-4%戊二醛 后固定：1%锇酸 4℃ 4℃ 1-2h或数月 2-4h 中间换3次 30min） 漂洗：用配固定液的缓冲液 4℃
1.5-2h（培养细胞
漂洗：
蒸百度文库水
4℃
常用的包埋剂
环氧树脂 –Epon812(进口) 渗入组织容易，对细 胞结构保存好，较常用 –618(国产) 低粘度包埋剂(Spurr) 组织结构保存好， 切片透明度高，电子束照射时稳定性好。 多用于能谱分析的样品包埋。 丙烯酸酯（acrylic resin) 具有低黏度、 亲和性强和优良的切割性能，并能耐受电 子束的轰击及在低温下聚合的特点。包括： LowcrylK4M、K11M、HM20、HM23
常用固定剂
戊二醛(Glutaraldehyde，GA)
–无色透明液体， pH4±，使用浓度为 2.5 ～ 4 ％，使用温度4℃。 – 优点
• 穿透能力强 • 能较好地保存蛋白质、碳水化合物的结构及酶的 活性 • 固定时间长(4℃可达数周至数月)
–
缺点
• 组织反差不好 • 对脂类无固定作用 • 固定后标本要充分冲洗
主要步骤
取材 固定 脱水 浸透及包埋 切片 染色
一.取材
从人体、动植物、细胞和微生物的培养物
中选取电镜观察材料的过程。 在活体取材时要做到： •快─离体1～2min内放入固定液 •准─取材部位要准，有代表性 •小─1mm×1mm×1mm大小，太小时结 构少，太大时固定不充分结构保存不 好 •轻─动作要轻，器械要锋利 •冷─0℃ ～ 4℃ ，器械、容器、固 定液均需预冷
五.切片
目的：制备厚度小于100nm的切片
准备工作:
1.复膜载网
• 支持膜 –formvar膜 –火棉胶膜 –碳膜 用于负染技术 • 支持网 –铜网 常用 –不锈钢网、镍网、铂网（组化用）
2.制刀 3.修块 –目的是去除组织块周围多余的包 埋介质，便于切片。 半薄切片: –目的是确定所要观察的准确部位， 厚度为0.5～1μ m，用甲苯胺兰染 色显示。
10min
原位固定法
多用于解剖关系比较复杂、质地柔软或
对缺氧比较敏感的组织。以保证器官的 血液供给，避免缺血造成的组织损伤或 自溶。 操作步骤 在动物麻醉后保持血液供应的条件 下，边解剖边在取材的部位局部滴加固 定液，直至组织达到适当的硬度为宜。
灌流固定法
指通过血液循环途径，将固定液灌 注到组织器官内，进行固定后再取材的 方法。常用于对缺氧敏感，死后变化快 的组织器官，如中枢神经系统、心脏、 胃肠道、视网膜和肾脏等。也可用于所 取组织的种类较多以及解剖关系比较复 杂、难以渗透的组织器官。 包括全身灌流固定法（适用于小动物） 和器官灌流固定法（适用于大动物）。
超薄切片技术
概念: 指制备厚度低于100nm的切片技术。 特点： • 是透射电镜生物样品制备技术中最 常见、最基本的技术； • 是其他技术方法的基础； • 程序长、操作较复杂、精细。
生物医学样品的特点：
1、样品多样化，包括组织、细胞、微 生物级生物大分子。 2、含水量多、质地软、脱水时容易皱 缩变形。 3、机械程度低，对电子束轰击的耐受 力差。 4、多由低原子序数的元素组成，故导 电性能差。 5、样品形态对试剂的PH值及温度较敏 感
二.固定
目的
–尽可能保存组织和细胞在生活状态下 的结构 –使细胞内的各种成分固定下来，避免 在以后的冲洗和脱水等步骤中溶解和流 失 –防止细胞内酶活性造成的细胞自溶 –防止外界微生物侵入繁殖而产生腐败 致使细胞的超微结构遭受破坏
方法 –物理方法 •快速冷冻法 •干燥法 –化学方法 •浸泡固定法 •原位固定法 •灌流固定法
多聚甲醛(Paraformaldehyde)
白色粉末，使用浓度为4％ 优点
–对组织的浸透力强 –保存抗原性物质，多用于免疫电镜技 术中 缺点 –高浓度时可使组织结构流失，多不单 独使用
常用缓冲液
用于配制固定液和漂洗 –0.2M磷酸盐缓冲液:较常用 –0.2M二甲砷酸盐缓冲液:用于电镜细 胞化学
性差
–丙酮:可溶解脂类，与包埋剂的互溶性好，
但易使组织变脆
脱水步骤
从低浓度至高浓度系列脱水
–50% 酒精 4℃ 10～15min –70% 酒精 4℃ 10～15min或过夜 –80% 酒精 室温 10～15min –90% 酒精 室温 10～15min –95% 酒精 室温 10～15min –95%酒精：95%丙酮（1：1）室温 10～15min –95%丙酮 室温 10～15min –无水丙酮 室温 40min 中间换一次
操作步骤（以全身灌流固定法为例）
麻醉要进行灌流的动物,将动 物固定于实验台上,打开胸腔暴露 心脏,将针头刺入左心室，剪开右 心耳以引出血液和灌流液。用注射 器或输液器缓慢注入37 ℃、 0.9%NaCl,直至内脏血色消失或流 出液无血色为止,注入4 ℃固定液， 待组织变硬后取材。
三.脱
水
目的 –将组织内部游离的水分脱净，有利于 浸透和包埋 常用脱水剂 –乙醇:使组织收缩较小，但与包埋剂的互溶
锇酸(Osmium tetroxide OsＯ4)
淡黄色块状结晶，使用浓度1～4％，使
用温度4℃。
优点
–对蛋白质和脂类有较好的固定作用 –可避免组织块收缩或膨胀 –可产生明显的反差 缺点 –分子量大，穿透能力差 –对碳水化合物和酶固定效果不好 –固定时间较长易引起组织变脆 –有强烈的刺激味对角膜、鼻粘膜有毒性作用 –光热作用时易发生变化
超薄切片:采用超薄切片机 –操作步骤: •包埋块固定 •刀固定 •水槽加水 •切片 •选片 •捞片
切片的厚度可根据干涉色来判断。 –暗灰色调 40nm –灰色 40-50nm，较薄，易被电 子 束击破 –银白色 50-70nm，最常用 –金黄色 70-80nm –紫色为 90nm以上，较厚，细节结 构不清
2 、切片及单层培养细胞（需要在玻片上
进行）： 在光镜下选出所需观察的部位，在玻片 反面用笔做好标记。前固定、漂洗、后固 定，脱水及浸透同常规包埋方法，但各步 骤时间可适当缩短。在玻片有标记处的正 面位置滴上包埋剂，将顶端平整的废包埋 块压在其上，于60 ℃聚合硬化。将粘有 包埋块的玻片置于90 ℃热板上加温10s， 取下包埋块修块，超薄切片及电子染色。
六.电子染色
利用重金属盐类选择性地与生物样品 中不同结构成分相结合，来提高结构成分 散射电子的能力，从而增加图像反差的染 色，又称为正染色。 常用的染色剂: –0.5％～１％醋酸双氧铀
• 可使核酸、蛋白质、结缔组织纤维的反差增强。
–0.1％～0.4％柠檬酸铅
• 可使膜结构、脂类的反差增强。
Lowcryl K4M：
为低温水溶性包埋剂，较常用。特 点是低温下(-35 ℃)可保持低黏度；在 紫外光（波长360nm）下可聚合。聚合 后可在常温下切片；能较好地保持组织 结构和抗原性及植物凝血素结合部位， 减少背景非特异性染色，故多用于免疫 细胞化学的包埋后染色。 包埋剂配方（K4M) K4M(单体） 8.65g 交联剂 1.35g 引发剂 50mg
LR white: 为混合的丙烯酸单体，对脂 类溶解度低，保存膜结构较好， 可耐受电子束轰击，因而可不做 支持膜。热聚合60 ℃ ， 24h；冷 聚合-25 ℃ ，加速剂协助聚合。
包埋方法
1.常规包埋方法 适用于大多数组织块及细胞团
浸透 –环氧丙烷 室温 20min –环氧丙烷:包埋剂 1:1 室温 –包埋剂 室温 3h 包埋聚合 –将样品放入包埋板或胶囊内 –充填满包埋剂 –放好标签 聚合(使包埋剂变硬) –35 ℃ 12h –45 ℃ 12h –55 ℃ 12h