第10章 有机酸的发酵生产

1. 合成途径
合成途径： 一个是EMP途径，由糖变成丙酮酸； 另一个是三羧酸循环途径。
柠檬酸合成总反应式
黑 曲 霉 合 成 柠 檬 酸 的 代 谢 途 径
2．生产原料
含有淀粉或糖的物质作为原料，首先生产菌 产生的淀粉酶把淀粉水解为葡萄糖，糖化酶 把糖蜜变为葡萄糖和果糖，最后由葡萄糖生 成柠檬酸。 以葡萄糖为原料生产柠檬酸理论发酵率为 106.7％，以淀粉为原料发酵率为118.5％。 但目前一般对淀粉的转化率仅达90％。
10.3 其他有机酸的发酵生产
1．延胡索酸：为无色针状或片状结晶或白 色结晶性粉末。难溶于水，微溶于乙醇， 200℃升华成烯酐。 延胡索酸是重要的化工原料，也是清凉饮 料中的酸味剂，是天门冬氨酸和苹果酸生 产的原料。 延胡索酸产生菌均属根霉与毛霉，我国使 用的是根霉，用薯干粉为原料发酵生产， 30℃左右3天培养，产率为40~50％。
3．提取
用离心、过滤或沉淀法分离菌丝体。 钙盐清液在搅拌下升温加石灰乳，使钙总 浓度达酸浓度的98％，100℃下浓缩到过饱 和，冷至20℃静置，葡萄糖酸钙结晶自然 析出。 或浓缩液用等浓度H2SO4酸化，并过滤除 去CaSO4结晶即可得葡萄糖酸溶液。 钠盐清液经活性炭脱色和阳离子交换得到 葡萄糖酸溶液，浓缩至过饱和后再冷至 30℃，可结晶出无水葡萄糖酸。
3．苹果酸：酸味刺激缓慢，达到最高酸味 后可保留较长时间，在国际市场上有取代 柠檬酸的趋势，它在医药、日用化工和化 学工业等方面也有广泛应用。 一步法采用黄曲菌、米曲菌、寄生曲菌等 菌种； 两步法及混合发酵法用华根霉、无根根霉、 短乳杆菌等菌种； 酶转化法用短乳杆菌、大肠杆菌、产氨短 杆菌等菌种。
第10章 有机酸的发酵生产
有机酸发酵可分为两大类： 一类与糖酵解和三羧酸循环有关的有机酸， 包括柠檬酸、乳酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、 延胡索酸、草酰乙酸、苹果酸等。 另一类是直接氧化生产的有机酸，包括乙 酸、葡萄糖酸、酒石酸等。
有机酸主要是作为酸味剂应用于食品、饮 料工业，能增加天然风味。 医药上用量较多的有柠檬酸钠(抗凝血剂)、 柠檬酸铁铵(补血剂)、葡萄糖酸锌、葡萄糖 酸钙、乳酸钙等。 乳酸亚铁是最近国外广泛使用的铁质食品 添加剂、饲料添加剂及补血药。 其他工业，如电镀、制革、纺织印染、日 用化工等用途也极为广泛。
4. 发酵工艺
柠檬酸发酵是好氧发酵，生产方式有表面 （浅盘）发酵、固体发酵和深层培养。 我国目前柠檬酸发酵以深层培养为主。 深层发酵有着发酵周期短，产率高，操作 简便，占地少等优点。
柠 檬 酸 深 层 液 体 发 酵 工 艺 流 程
（2）工艺控制
①原料处理：原料粉碎，含水量60％。除 去糖蜜中金属离子，降低乌头酸酶及异柠 檬酸合成酶活性。 ②培养基：一般来说，糖浓度较高，柠檬 酸产量也会相应提高。薯干粉种子培养基 为8％~10％，发酵培养基为10％~16%， 一般为12％，浓度太高会导致发酵终了时 残糖较高，反而降低了总的转化率。 供给适量氮源和无机盐、生长因子，原料 和菌种不同，添加种类和数量也就不同。
3．生产菌种
很多微生物能形成柠檬酸，发酵生产中常 用的菌种有两种： 一种是以石油为原料生产柠檬酸的菌种， 多是解脂假丝酵母，目前很少有人采用； 另一种是以糖质原料生产柠檬酸的黑曲霉。
常用优良黑曲霉菌种是由产糖化酶的出发 菌株，经诱变处理筛选出来的，它们有以 下优点： （1）菌种的柠檬酸合成酶的活性比较高， 能大量合成柠檬酸。 （2）菌种是抗金属离子的变异株。某些金 属离子的村存在回降低产量。 （3）菌种产酸高、耐酸、耐高渗，可适应 高糖低pH环境。
④树脂净化：在柠檬酸酸解液中，混有发 酵和提取过滤过程中带入的大量杂质。如 Ca2+，Fe3+等金属离子，影响产品质量， 所以多采用强酸型阳离子交换树脂去除这 些金属离子。 ⑤浓缩与结晶：在50℃~60℃（温度过高则 柠檬酸分解为乌头酸）减压浓缩至 36.5~37°Bé，再缓慢搅拌降温结晶。 ⑥干燥：用沸腾干燥箱，去除晶体表面的 自由水，温度控制在35℃以下，否则会失 去一部分结晶水。
有机酸生产方法有：从果实中提取、化学 合成、发酵法或酶转化法。 柠檬酸产量较大，我国年产14万吨，仅次 于美国，居世界第二，70％出口。 我国乳酸也大部分出口，经济效益较好， 但其他种类基本属于空白。
柠檬酸的发酵
柠檬酸又称枸橼酸，学名3-羟基-羧基戊二 酸，分子式H3C6H5O7· 2O，无色、无臭、 H 半透明结晶或白色粉木，易溶于水及酒精， 是生物体主要代谢产物之一。 柠檬酸具有令人愉快的酸味，入口爽快，无 后酸味，安全无毒，是发酵法生产中最重要 的有机酸，能被生物体直接吸收代谢。
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2．乳酸（α-羟基丙酸）是重要有机酸之一。 可用作食品和饮料的酸味剂、防腐剂；医 疗行业的消毒剂和防腐剂；制革、纺织、 印染化工等行业广泛使用乳酸衍生物。 乳酸发酵菌种有德氏乳杆菌和保加利亚乳 杆菌及嗜酸乳杆菌等细菌。 近年来，有用霉菌生产乳酸，如根霉（最 重要的为米根霉）或毛霉。 乳酸合成途径为：葡萄糖→丙酮酸→乳酸
1．生产菌种
曲霉、醋酸菌、多种青霉(尤其是产黄青霉)、 几种假单孢菌以及其他几种菌。 工业上常用的是醋酸菌和黑曲霉，特别是黑 曲霉，在高糖浓度和微酸条件下能迅速氧化 葡萄糖成葡萄糖酸，转化率在95％以上。
2．发酵工艺
液体深层发酵多采用高浓度水解糖（25％ ~35％）和无机氮源，发酵时间40h。培养基 中加入CaCO3，或在发解过程中添加50％的 NaOH溶液，使pH值保持在5.5~6.5之间。 目前已采用连续发酵法和固定化细胞连续生 产葡萄糖酸。 斜面菌种→摇瓶种子→种子罐→发酵罐→过 滤浓缩→活性碳脱色→阳离子交换树脂脱钠 →葡萄糖酸
5．提取
目前我国多采用碳酸钙中和法提取柠檬酸， 再经过精制成为纯品： （1）柠檬酸提取工艺流程
碳酸钙中和法中的反应
、
柠檬酸提取工艺流程
（2）碳酸钙中和法提取工艺的控制
①发酵液预处理：成熟的发酵液用蒸汽加 热至100℃后再放罐。其作用是终止发酵， 使蛋白质变性凝固，易于过滤，使菌丝受 热破裂，彻底释放菌体内的柠檬酸。 ②碳酸钙中和：发酵液注入罐内，用蒸汽 直接加热至60℃~80℃，加入碳酸钙，搅拌， 达到终点后，趁热过滤，并用热水洗涤钙 盐。
③磷酸果糖激酶（PFK）活性的调节：在 葡萄糖到柠檬酸合成过程中，PFK是一种 调节酶，其活性受到柠檬酸的强烈抑制。 微生物体内NH4+可解除柠檬校对PFK的这 种反馈抑制，在Mn2+缺乏的培养基中NH4+ 浓度异常高，进而解除柠檬酸对PFK活性 的抑制作用，生成大量柠檬酸。
④pH：发酵是一个边糖化边产酸的过程， 由同一种菌种在同一生活环境中完成，但 两过程最适pH不同。 最初以糖化为主，黑曲霉的淀粉酶比较耐 酸，糖化过程最适pH为2.5~3.0，产酸最适 pH为2.0~2.5。 产酸后，为防防止pH下降抑制淀粉酶活性， 可调节通气与搅拌速度，前期通气量低一 些对糖化有利，发酵过程中可分阶段逐步 提高通气量；或在pH降至2.0时，加入灭菌 的碳酸钙乳剂，中和部分酸，使pH回升至 2.5左右。但中和剂用量要适度，pH过高则 会产生大量杂酸(主要是草酸)。
化学合成的苹果酸为D-型和L-型的混合物。 目前我国和日本等国已研究出固定化菌体 （含延胡索酸酶），进行L-苹果酸的连续生 产，我国利用的是固定化酵母细胞转化延胡 索酸。
4．琥珀酸、α-酮戊二酸和衣康酸 琥珀酸生产采用直接发酵法，由短杆菌(如 黄色短杆菌)深层发酵葡萄糖，产率为30％， 也可利用微生物转化延胡索酸，生产琥珀 酸。 α-酮戊二酸可由酮戊二酸杆菌、克鲁维氏 酵母菌发酵生成。 衣康酸是柠檬酸受热分解后的产物，是重 要的化工原料。产生菌多为曲霉属的菌株， 如地曲霉、土曲霉等。发酵葡萄糖4 ~7天， 最高产率为50％左右。
柠檬酸主要应用于食品工业，作为食品的 酸味料，用于饮料、果酱果冻、酿造洒、 冰淇淋、人造奶油、腌制品、罐头、豆制 品以及调味品等。 医药行业，柠檬酸糖浆及各种柠檬酸盐(如 柠檬酸铁、柠檬酸钠等)广泛用于临床及生 化检验。 化工行业常用于缓冲剂、抗氧化剂、除腥 脱臭剂、螯合剂等。 还可用于多种纤维的媒染剂，聚丙烯塑料 的发泡剂。
葡萄糖酸与碳酸钙或石灰中和生成的葡萄 糖酸钙，可治疗生理性缺钙症和血钙过低 所引起手足抽搐、痉挛等症，以及治疗软 骨、佝偻等缺钙症，食品工业中用来制作 果酱等。 葡萄糖酸水溶液可形成葡萄糖酸δ-内酯和 葡萄糖酸γ-内酯，三者等量混合存在。 葡萄糖酸δ-内酯是食品添加剂，可作为凝 固剂、膨松剂、酸味剂。
目前我国柠檬酸生产的产酸率和提取率与 国外先进水平差距较大。 生产设备方面，国外正向大型化和自动化 发展，最大的发酵罐已达1400m3，一般为 250m3以上，并采用微机控制，我国最大 的才150 m3，一般采用30m3和50 m3，自 动控制水平很低。 在提取设备方面，国外采用真空带式过滤 机，连续结晶，多效蒸发，我国仍用板框 过滤，间歇结晶，单效蒸发设备，所以提 取率低，能耗高。
⑤温度：种子培养温度比发酵温度高 1℃~2℃，为32~33℃左右，发酵要求温度 在31℃左右，太高会产生杂酸，影响柠檬 酸收率。 ⑥时间：发酵时间约4天左右。 ⑦通气与搅拌：一方面粘性物质不断水解， 粘度下降，另一方面菌丝体大量繁殖，也 会使溶氧系数大大下降。以糖蜜为原料时， 通气时极易发孢，得加消泡剂才行，但消 泡剂也会大大降低溶解氧浓度。
③酸解脱色：中和并洗净的柠檬酸钙不宜过 久贮放，应迅速进行酸解。 酸解时先把柠檬酸钙用水调成糊状，加热至 85℃，缓慢加入适量硫酸，理论上加入硫酸 量为碳酸钙的98％(m／m)，因中和时生成 少量可溶性杂酸的钙盐，以及过滤洗涤时有 少量柠檬酸钙损失，实际硫酸加入量为碳酸 钙用量的92％~95％为宜。 酸解达到终点后，加入活性炭脱色，或用树 脂脱色。活性炭用量一般为柠檬酸量的1％ ~3％，35℃保温30 min，即可真空抽滤或 离心分离；用树脂脱色时，先滤去硫酸钙沉 淀，再将清液通过脱色树脂柱脱色。
（3）电渗析法提取工艺：技术要求较高， 国内很少使用。
发 80℃ 过 酵 滤 液
菌渣 滤液 电渗析 去离子 纯净的 浓缩 柠檬酸 结晶
10.2 葡萄糖酸的发酵生产
葡萄糖酸（五羟基己酸）是一种有机弱酸， 含4个不对称碳原子，是制药工业和食品工 业的重要原料，在建筑、化妆品、纺织、 塑料制造上也有应用。 20世纪20~30年代，发现某些微生物可以 发酵葡萄糖成葡萄糖酸。 20世纪50年代，流加氢氧化钠生产葡萄糖 酸钠，发酵时间为20 h，成为现代深层发 酵葡萄糠酸的基础。