蛋白质结构分析方法

蛋白质结构分析方法：X射线晶体衍射分析和核磁共振

x 射线衍射法的分辨率可达到原子的水平，使它可以测定亚基的空间结构、各亚基间的相对拓扑布局，还可清楚的描述配体存在与否对蛋白质的影响。多维核磁共振波谱技术已成为确定蛋白质和核酸等生物分子溶液三维结构的唯一有效手段。NM R技术最大的优点不在于它的分辨率，而在于它能对溶液中和非晶态的蛋白质进行测量。

蛋白质的序列结构测定:

1.到目前为止，最经典的蛋白质的氨基酸序列分析方法是，sarI等人基于Edman降解原理研制的液相蛋白质序列仪，及后来发展的固相和气相的蛋白质序列分析仪。

2.质谱：早期的质谱电离的方式主要是电子轰击电离(EI)，它要求样品的挥发性好，一般与气相色谱联用。但使用G C／M S分析，肽的长度受到限制，只能分析小的肽段。近年来，在离子化的技术及仪器方面取得了突破性进展，使得质谱所能测定的分子量的范围大大超出了10k u。因此，软离子化技术、基质辅助的激光解吸／离子化(MALDI)和电喷雾离子化(E SI)显得尤为有前途。通过串联质谱技术(MS／MS)和源后衰减基质辅助的激光解吸／离子化(PSD—MAIDI—MS)，人们就可以从质谱分析中获得肽及蛋白质的结构信息。

蛋白质三维结构的研究：

1.X射线单晶衍射分析

2.核磁共振分析

3.蛋白质的二维晶体与三级重构：

蛋白质二维结晶及其电子晶体学的结构分析是目前结构生物学最活跃的领域之一。此法既适用于水溶性蛋白质，也适用于脂溶性膜蛋白的研究。电子晶体学的结构分析源于早期的电子衍射分析。与X射线衍射方法类似，电子衍射数据的实验分析得到的只是结构因子的振幅部分，丢掉了相位信息。但从剑桥MRC分子生物学实验室的Klug和DeRo sier建立了三维重构的方法开始，电子晶体学才真正发展成为一种独立的空间结构的分析方法，并从传统的X射线晶体学中脱胎出来。所谓电镜图像的三维重构是指由样品的一个或多个投影图得到样品中各成分之间的三维关系。这一方法的基本思路是电子显微图像含有振幅和相位的信息，二者可通过数字图像处理的傅立叶变换方法提取出来。蛋白质溶液构想的光谱技术：

紫外-可见差光谱：紫外一可见差光谱也是电子光谱，由电子跃迁产生。而蛋白质在紫外区的光吸收是由于芳香族氨基酸侧链吸收光引起的。可见区的研究则限于蛋白质一蛋白质、酶一辅酶、酶一底物的相互作用等，有时还需引人生色团才能进行。差光谱的产生是基于生色团经受一定的环境变化时，吸收峰发生位移，吸光度和谱带半宽度也有改变。生色团经受的这种环境变化称为微扰作用，变化后和变化前的光谱差称为差光谱。根据差光谱的光谱参数，可以推断这些生色团在大分子中是隐藏的半暴露的还是暴露的。

荧光探针法：荧光光谱法是研究蛋白质分子构象的一种有效方法，它能提供包括激发光谱、发射光谱、斯托克斯位移，荧光强度、总荧光量、量子产率、荧光偏振和荧光寿命等参数，这些参数从各个角度反映了分子的成键和结构情况。通过这些参数的测定，不但可以做一般的定量分析，而且还可以推断蛋白质分子在各种环境下的构象变化，从而阐明蛋白质分子在各种环境下的构象变化，进而阐明蛋白质结构与功能之间的关系。

圆二色谱：圆二色性和旋光色散都可用于测定分子的立体结构。旋光色散利用不对称分子对左、右圆偏振光折射的不同进行结构分析，而圆二色性则利用不对称分子对左、右圆偏振光吸收的不同进行结构分析。在蛋白质分子中，每个氨基酸残基的a碳是不对称碳，再加上主链构象也是不对称结构，因而蛋白质分子具有光学活性。通过圆二色的测定和计算可以了解蛋白质分子在溶液状态下的二级结构。圆二色对构象变化敏感，故它可灵敏的检测一些反应引起的构象变化，特别是用于观测蛋白质的变性是最方便的.

激光拉曼光谱：拉曼光谱是研究分子振动和转动光谱的重要手段，它是没有任何遮蔽效应的不破坏样品的光谱技术之一，可提供的蛋白质结构信息很丰富，还可在生理环境或活体中做实验，能更真实地反映生命过程。激光拉曼光谱是基于拉曼散射和瑞利散射的光谱。随着数学和物理学的发展，傅立叶变换拉曼光谱(FT—Paman)和紫外一共振拉曼光谱成为当前拉曼光谱发展的主要方向。在傅立叶变换红外光谱中曲线拟和方法主要有两种：一种是Byler等采用的傅立叶去卷积谱，另一种是Surewize等采用的傅立叶原始光谱川。这两种对蛋白质二级结构的定理方法，都是以去卷积和求导数光谱的方法对蛋白质拉曼光谱酰胺I带分峰及确定各子峰峰位，并以子峰面积表征对应二级结构相对的百分含量。从而提高了信噪比和精度。紫外一共振拉曼光谱成功的利用蛋白质在紫外区具有吸收性质，使紫外共振激发蛋白质分子成为可能，在很大程度上提高了拉曼散射截面，而且紫外激发消除了荧光干扰，提高了信噪比。

红外光谱：红外光谱在研究蛋白质二级结构中的应用傅立叶变换红外光谱(FTIR)现已广泛应用于蛋白质二级结构的分析，其中大量的研究主要是在重水溶液中进行的。最近几年，采用很薄的吸收池可成功的进行水溶液中蛋白质的结构分析。对二级结构的定量，现有拟合、偏最／b -乘及因子分析法等。其中，偏最小二乘法对于蛋白质二级结构的定量在理论和实际上都是一种更加准确可靠的方法。当前，虽然众多技术为蛋白质空间结构测定提供了有效的实验手段，并正以平均每天得到几个生物大分子空间结构的速度前进。但是这些方法提供蛋白质三维结构的速度还远小于蛋白质序列信息的增长速度。另外，这些方法依然存在局限性。X射线晶体学技术需要得到适当的蛋白质晶体；NMR技术现在还不能有效地测定相对分子质量大于3万的样品；电子晶体学技术现在还正在发展。人们尚不能估计有多少人类蛋白质最终可由上述方法测定，又有多少蛋白质不能测定。