结核病实验室诊断201609

灵敏度
基本不受免疫力低下/受抑制影响，在肺外结核患者中有 很高的检出率 美国FDA数据：灵敏度95.6%(175/183) 国内临床数据：灵敏度95.3%(624/655)
体外r-干扰素释放试验
结核分枝杆菌体外药敏试验
结核分枝杆菌液体微量显色法药敏试验比对实验
收集临床分离菌株和国家参比室的质控菌株117例，使 用液体微量显色法和罗氏比例法进行了利福平、异烟肼、 链霉素、乙胺丁醇、卷曲霉素、氧氟沙星、乙硫异烟胺、 对氨基水杨酸、左氧氟沙星、莫西沙星、 利福布丁、阿米卡星、卡那霉素、 氯苯吩嗪等十四种抗结核药物的比对实验。 总符合率超过90%。
操作步骤
结核病分子生物学诊断
2015年6月，我科参加CTCTC“EasyNAT®结核分枝杆菌核酸 检测试剂盒现场应用评估”项目,结果如下：
EasyNAT TB-DNA检测
患者类型
例数
阳性 阴性 0 41 1* 40
阳性率 % 100.0 4.7 90.0 0.0
涂片阳性 涂片阴性 培养阳性 培养阴性
• 操作完全自动化，
使用起来既容易又安全。
结核病分子生物学诊断
Xpert MTB/RIF与PCR TB-DNA检测的比较： • 阳性符合率＝99.03％，阴性符合率＝92.61％，总符合率 ＝95.31％
PCR TB-DNA
Gen-Xpert
阳性
阳
阴
合计
阴性
21
263
性
性
204
2
225
265
合
计
206
背景—结核分枝杆菌基础
• （1）结核杆菌可经多途径感染，由呼吸道、消化道和破损皮肤侵入
机体，最常见为经呼吸道感染引起肺结核。 • （2）结核杆菌无内毒素和外毒素，也不产生侵袭性酶，其致病性主 要与其细胞壁内含大量脂质有关。主要包括： • • ①磷脂：可刺激单核细胞增生，与结核结节和干酪样坏死形成有关 ②分枝菌酸：与抗酸染色性有关
药物 耐药 例数 耐药率 % RFP 80
15.7
INH 146
28.6
SM 94
18.4
EMB 58
11.4
CPM 50
9.8
OFX 61
11.9
ETH PAS 41
8.0
LVF 53
10.4
MOF 62
12.1
RFB 60
11.7
AMI KAN 11
2.2
CLO 87
17.0
49
9.6
13
2.5
284
490
结核病分子生物学诊断
• 涂片阳性肺结核: Xpert 检出率=99.35％ • 涂片阴性肺结核: Xpert 检出率=35.32％
涂片结果 Gen-Xpert 合计
阳性
阳 性 阴 性 合 计 152 1 153
阴性
71 130 201 223 131 354
结核病分子生物学诊断
Xpert MTB/RIF与BD960液体培养比较实验：
1.HPLC 2.质谱技术 3.流式技术
结核分枝杆菌形态学检测
涂片
染色
镜检
1.直接抹片法 2.离心制片法
1.抗酸染色 2.荧光染色
1.普通显微镜 2.荧光显微镜 3.自动阅片技术
结核杆菌离心制片技术
2015年7月至2015年11月，对本院257例痰液和纤维支气管镜灌洗液进行 直接涂片法和离心制片法比对验证试验，结果如下：
原理：将病原体DNA扩增、核酸杂交和核酸试纸条检测三种 技术有机地融为一体，在恒温扩增反应中加入两对TB特异 性引物、一对特异性探针，同时 一次性完成TB DNA的扩增及杂交 过程，然后用一次性核酸检测装 置进行定性诊断。 检测目标片段:目标为结核分枝杆菌 特异性IS6110片段。
结核病分子生物学诊断
比例法药敏 溶解曲线法 敏 感 敏 感 110 耐 药 4
敏感度 % 90.5 95.8
特异度 % 98.2 97.2
阳 性 预测值 % 95.5 94.1
阴 性 总符 预wk.baidu.com值 合率 % % 96.6 98.1 96.1 96.8
INH RFP
耐 药
敏 感 耐 药
2
103 3
38
2 46
结核病分子生物学诊断
利福平药敏试验
Gen-Xpert
耐药（阳性） 耐药（阳性） 不确定 敏感（阴性） 合计 31 0 1 32 敏感（阴性） 8 2 171 179
合计 39 2 172 211
结核病分子生物学诊断
WHO关于Xpert MTB/RIF的建议 • Xpert MTB/RIF 应该用于MDR-TB的高危人群、 以便尽早发现MDR-TB患者，有效控制疫情。
——《中国实验诊断学》 2009年01期
• •
降钙素原（PCT） 肺结核患者血清PCT水平明显低于社区获得性肺炎（CAP）患者，HIV阴性 的肺结核患者血清PCT水平并不会明显增高，故可用于PTB和CAP的鉴别诊 断，但当PCT水平大于正常值时，其预后价值较差。可作为肺结核和肺结核 伴感染诊断的辅助指标。
•
• •
③索状因子：可破坏细胞线粒体膜，与慢性肉芽肿形成有关
④硫酸脑苷酯：抑制吞噬溶酶体形成，具有抗吞噬作用 ⑤ 蜡质D，可刺激机体的迟发型超敏反应。
• （3）结核杆菌主要引起细胞免疫反应，属于传染性免疫
结核病患者的常规检验
• • • • 三大常规（血常规、尿常规、大便常规） 血沉 血流变检测 肺结核患者血液粘滞性、凝固性、聚集性 均增高，血流缓慢，易于促成肺内微血栓 形成
直 接 涂 片 法 阳 性 阴 性 合 计 离心制片法 合 计 阳 性 41 17 58 （22.6%） 阴 性 0 199 199 (77.4%) 41 (15.9%) 216 (84.1%) 257
结论：离心制片法的确能提高结核杆菌涂片检测的阳性率。
结核杆菌自动阅片技术
• 2016年2月至2016年3月，本院对308例涂片进行人工阅片 和计算机自动阅片比对试验；结果符合的为286例，总符 合率为92.58%。
结核分枝杆菌体外药敏试验
1
挑取菌落 磨菌、稀释
2
接种菌液
3
孵育7-10天
4
显色， 读取结果
结核分枝杆菌液体微量药敏
结核分枝杆菌体外药敏试验
结核分枝杆菌液体微量显色法药敏试验
收集我院2015年8月至11月的临床分离菌株511例， 使用液体微量显色法进行了利福平、异烟肼、链霉素、 乙胺丁醇、卷曲霉素、氧氟沙星、乙硫异烟胺对氨基水 杨酸、左氧氟沙星、莫西沙星、利福布丁、阿米卡星、 卡那霉素、氯苯吩嗪等十四种抗结核药物的体外药敏试 验 。其中MDR-TB菌株75例（14.7%）。
治疗 Treatment
康复 Recovery
肺病或其他疾病
痊愈
复发
≥ 2 个月（months）
时间表Time
背景—当前结核病的研究
新型抗结核药物(50%)
新型快速诊断技术(40%)
新型结核疫苗(10%)
JID 2012:205 (Suppl 2), S147.
背景—结核分枝杆菌基础
• 结核分枝杆菌（M. tuberculosis） 简称为结核杆菌（tubercle bacilli）。早在1882年，德国细菌 学家柯赫（Robert Koch）就已证明 结核分枝杆菌是结核病的病原菌。 本菌可侵犯全身各组织器官，但以 肺部感染最多见。 • 在微生物分类中，结核分枝杆菌属于 放线菌门、放线菌纲、放线菌目、分 枝杆菌科、分枝杆菌属 • 分枝杆菌复合群共包括人型、牛型、 非洲型和田鼠型，而人型结核分枝杆 菌是人类主要的致病菌
• Xpert MTB/RIF 在MDR或HIV问题不十分严重 的地区，可以考虑作为显微镜检查基础之上 的后续检测，特别是用于涂阴标本的进一步 检测。
体外r-干扰素释放试验
• 蛋白质水平
结核菌素试验（TST）
T-SPOT.TB
潜伏性结核 （LTBI）
QuantiFERON-TB Gold in-tube (QFT-GI)
——《微循环学杂志》
常规检测，无特异性。
结核病患者的常规检验
• 腺苷脱氨酶（ADA）:其血清/浆膜腔积液比值更有意义。
• C反应蛋白 （CRP）: X线提示有空洞的结核病人比没有 空洞的结核病人以及健康人显著升高。但是CRP正常不能 排除结核病。
——Infection.17(1):13-4,1989 Jan-Feb
结核分枝杆菌体外药敏试验
固体 培养法
结核杆菌体外 药敏试验
MIC 测定法
液体
仪器法
液体
微量法
结核分枝杆菌体外药敏试验
Drug free Isoniazid Ethambutol Inoculum media 0.2 mcg/ml 2.0 mcg/ml 10-3 ++++ ++ 3 10-5 26 9 0 % resistant 34.6 0.1 Interpretation Resistant Susceptible
二、结核分枝杆菌RNA检测(TB-RNA)
RNA作为临床分子诊断靶标的优点： RNA 拷贝数≥ DNA拷贝数 更具临床意义: 生命力旺盛的病原体RNA转录活跃 RNA远不如DNA稳定，病原体死亡，RNA很快降解 1.交叉污染少 2.较好的愈后指标
结核病分子生物学诊断
统计今年我院住院患者179例，分析涂片、 培养和TB-RNA检测报告，结果如下：
7 43 10 40
7 2 9 0
注*：1例培养阳性最终鉴定为非结核分枝杆菌
结核病分子生物学诊断
四、Gen-Xpert MTB/RIF
• 进行标本处理、实时PCR和利福平耐药性检测的完整平台
• 痰标本可以直接放入模块中，而无需与任何试剂进行混合 处理
• GeneXpert 设备可进行标本液化、去污染、富集、DNA提 取、 rpoB实时扩增、应用分子灯塔检测耐药相关的突变 • 容易使用，不需要进行分子生物学培训
体外r-干扰素释放试验
γ 干扰素
检测阴性
γ干扰素 检测阳性
TB抗原多肽
T细胞
活化T细胞
γ 干扰素
体外r-干扰素释放试验
特异性
只针对结核分枝杆菌复合群敏感，与绝大多数环境分枝杆 菌和卡介苗（BCG）无交叉反应 美国FDA数据：特异性97.1%(297/306) 国内临床数据：特异性94.1%(478/508)
——[Eur Respir J 2011; 37(2):371]
结核病实验室诊断技术简介
细菌学 免疫学 分子生物学 其他
1.涂片 2.培养 3.药敏 4.菌型鉴定
1.结核抗体 2.结核蛋白 芯片 3.体外r-干 扰素试验 4.结核杆菌 分泌抗原
1.实时荧光 定量PCR 2.DNA 3.RNA 4.耐药基因 突变 5.菌型鉴定 6.测序
患者类型 涂片阳性 例数 27 TB-RNA 阳性例数 23 阳性率 85.2%
涂片阴性
培养阳性
142
68
41
62
28.9%
91.1%
培养阴性
111
2
1.8%
我院涂片、培养阳性率分别为：15.1%和37.9%；TB-RNA 的总阳性率为35.8%。
结核病分子生物学诊断
三、EasyNAT TB-DNA检测（恒温扩增法）
结核病实验室诊断
检 验 科 任 易
1. 结核病背景资料 2. 结核病常规检验 3. 结核病实验室诊断
4.体外r-干扰素释放试验
5.小 结
背景—结核病流行现状
全球有三分之一人口（20亿）
感染了结核杆菌
我国现患肺结核病人达500万， 占全球病人总数的1/4
背景—结核病感染、传播、发病过程
播散 Disseminates 诊断 Diagnosis 发作 Onset 细菌在人 体复制 潜伏感染 染
• 辅助治疗检测：肝功能、肾功能、血脂、血糖。。。。
• NSE 、AFU等指标用于鉴别诊断。 • CA 125标志的使用，可以作为结核病疗效判断指标。结核病与肺部 肿瘤患者均升高。
——《中国实用内科杂志》2003年 第2期
结核病患者的常规检验
• 超敏C反应蛋白：肺结核是结核分枝杆菌感染导致机体细胞免疫功能下降的 慢性呼吸道传染病，患者血清中HS—CRP、免疫球蛋白、补体可发生改变。
• 阳性符合率＝95.52％，阴性符合率＝95.51％，总符合率= 95.51％
培养+鉴定结果
Gen-Xpert 阳性
阳性 阴性 213 10
合计
225 265
阴性
12 255
合计
223
267
490
结核病分子生物学诊断
Xpert MTB/RIF与比例法药敏比较实验： • 阳性符合率 ＝96.88％，阴性符合率 ＝95.53％，总符合 率 ＝95.73％，
结核病分子生物学诊断
一、结核分枝杆菌探针溶解曲线技术
结核病分子生物学诊断
结 果 判 断
结核病分子生物学诊断
收集我院样本库的临床分离菌株154例，进行了溶解曲线法 耐药基因突变分析以及罗氏比例法药敏试验，总符合率在 96%以上。并对耐药结果不相符的11株菌进行了基因测序分 析，均证实有耐药基因突变。