表达谱芯片数据分析项目示例

芯片项目分析内容说明（示例）：

1）原始芯片数据处理：

我们重老师提供的数据列表中下载了408张非重复的芯片，这些芯片来自13批不同的数据，首先，我们使用RMA算法对每一个批次的芯片，分批进行了信号值处理，经过PCA分析后发现，不同的芯片按照不同的批次被分开，说明来自不同实验的数据之间存在非常强的批次效应。

对应文件为: 01原始芯片数据处理\RMA_in_Batches\all_exp.xls.PCA3D.pdf

截止，我们将所有芯片的放在一起，一起使用RMA算法进行信号值处理，经过PCA分析后发现，纵使是将所有芯片一起进行RMA处理，这些来自不同实验的数据还是存在批次效应。对应文件为：01原始芯片数据处理\RMA_in_Batches\ all_exp.xls.PCA3D.pdf

2）批次效应矫正：

因为，来自不同实验的数据之间存在批次效应，所以我们使用基于经验贝叶斯方法的ComBat 算法对不同批次的数据进行批次效应矫正。

我们使用将全部芯片放在一起进行RMA处理后的数据作为输入文件，进行批次效应表达量矫正，然后使用PCA分析发现，批次效应基本被消除掉了。

对应文件为：02批次效应矫正\校正前\all_exp.xls.PCA3D.pdf

02批次效应矫正\校正后\Adjusted.all_exp.xls.out.xls.out.PCA3D.pdf

3）差异分析:

我们使用t_test和方差分析对批次效应矫正前后的数据都进行差异检测，我们使用t_test的pvalue<0.01和方差分析的pvalue<0.01为标准选取差异基因，对于校正后我们共得到26760个差异探针，对于校正前我们23349个差异探针，我们对得到的差异探针都经行了PCA分析和cluster分析

对应文件：03差异表达\

4）特征选择：

我们使用SVMRFE算法，一种基于支持向量机的特征选取算法，对差异探针，进行了特诊选择。我们对校正前和校正后的差异探针都进行了特征选择

SVMRFE会将特征基因按照从高到低的顺序进行排序，我们选择排名前10,前20，前30，前40的探针，进行PCA分析，观测使用特征基因进行分类是否准确。

对应文件：04SVMRFE\

其中nohup.out文件为进行SVM分类时，选取不同数量特征基因，使用留一法交叉验证所得到的准确率。

下图为特征选择前后样本的热图分析结果。

SVM分析前（2562 genes）SVM分析后（19 genes）

5）异常样本去除：

我们使用PCA分析得到样本在PC1，PC2，PC3上的位置，然后计算每个样本在3个PC上与其均值的距离的平方，然后分别乘以其PC权重后求和，然后求z score，对求得的zscore值进行高斯累积分布，然后将值大于0.8的样本作为离群样本，去除掉。对于肿瘤样本，和正常样本我们分别计算各自的离群样本。

对于批次校正前的数据，我们得到癌症的离群样本为41，正常的离群样本为7

对于其次矫正后的数据，我们得到癌症的离群样本为49，正常的离群样本为7

对应文件夹：05离群样本检测_PCA_Gaussian_cumulative_distribution/

下图为3D PCA结果（例图）

6）去除异常样本后重新进行SVMRFE：

我们将异常样本去除后，又重新进行了SVMRFE特征选择。

结果目录：06去掉离群样本/

7）批次校正对结果影响的评估

从结果来看，不使用批次矫正得到结果更优，其原因是因为，本次芯片数据时正常和肿瘤样本的数量极度不对称，且有些批次的数据全部为肿瘤样本，在此种情况下进行批次矫正会产生过矫正。即将肿瘤样本的特征，当做批次特征，进行矫正，这种情况下即产生了过矫正效应，不能反应样本真实情况。建议使用批次校正前的数据进行后面的参数优化

8）异常样本去除参数优化：

之前我们使用PCA+高斯累计分布，使用参数0.8的时候，

对于批次校正前的数据，我们得到癌症的离群样本为41，正常的离群样本为7。

后面我们调整了这个参数的设置，使用参数0.95的时候，

对于批次校正前的数据，我们得到癌症的离群样本为16，正常的离群样本为7。

后面我们在此调整了这个参数的设置，使用参数0.99的时候，

对于批次校正前的数据，我们得到癌症的离群样本为12，正常的离群样本为3。

从结果看使用0.99为参数去掉异常样本后分析的结果会出现错分的情况，而使用0.95为参数则没有出现错分的情况。