连锁遗传分析与染色体作图

第四章连锁遗传分析与染色体作图
第一节连锁与交换
本章主要内容：
I. 连锁交换定律：连锁交换定律的发现及内容，
II. 基因定位与染色体作图：交换率的计算，连锁作图，三点测交方法进行连锁作图，真菌的四分子分析方法，着丝粒作图，基因转变与重组机理，转座子的分类及转座机理
III. 人类基因组和染色体作图
本章要点:
连锁与交换，链孢霉的顺序四分子分析，重组机理，转座，人类连锁分析本章授课内容：
问题:
基因在染色体上如何排列？
同一条染色体上的基因之间在遗传时如何相互作用？
一、连锁交换定律
（一）连锁交换定律的发现
相引与相斥
1906 ，贝特逊（Bateson, W.）和庞尼特（Punnet, R.C）利用香豌豆（Lathyrus doratus）为材料提出相引（coupling）及相斥（repulsion）
Bateson-Punnet 香豌豆杂交试验，例1：
P: 紫花长花粉×红花圆花粉
↓
F1: 紫花长花粉
↓
表型观察数(O) 期望比例期望值(E)
F2: 紫长 4831 9 3910.5
紫圆 390 3 1303.5
红长 393 3 1303.5
红圆 1338 1 434.5
总计 6952
χ2 = ∑(Oi-Ei)2/Ei=3371.58
df=4-1=3, 差异极显著，结果不符合自由组合定律， F2代中性状的亲组合类型远远多于重组类型。

例2：
P: 紫花圆花粉×红花长花粉
↓
F1: 紫花长花粉
↓
表型观察数(O) 期望比例期望值(E)
F2: 紫长 226 9 235.8
紫圆 95 3 78.5
红长 97 3 78.5
红圆 1 1 26.2
总计 419
χ2 = ∑(Oi-Ei)2/Ei=32.4 ，df=4-1=3, 差异极显著，结果不符合自由组合定律。

Batson等：
互引相(coupling phase) 前一种亲本组合
互斥相(repulsion phase) 后一种亲本组合1912年，摩尔根：连锁交换定律：凡是伴性遗传的基因，相互之间总是连锁的。

（二）、连锁与交换
连锁(linkage):
1、摩尔根的试验：
P: 灰体长翅(BBVV) ×黑体残翅(bbvv)
↓
F1: 灰体长翅(BbVv) ♂♀
测交1：
灰体长翅(BbVv) ♂×黑体残翅(bbvv) ♀
↓
灰体长翅(BbVv) : 黑体残翅(bbvv) =1 : 1
测交2：
灰体长翅(BbVv) ♀×黑体残翅(bbvv) ♂
↓
灰体长翅(BbVv) : 0.42
黑体长翅(bbVv) : 0.08
灰体残翅(Bbvv) : 0.08
黑体残翅(bbvv) : 0.42
测交子代虽然出现了四种类型，但是重组类型显著少于亲本类型。

摩尔根的解释：
基因B、V处于同一条染色体上，而其等位基因b、v位于同源染色体的另一条上。

减数分裂时不能独立分配和自由组合。

2、完全连锁(Complete linkage):如测交1：基因完全连锁，不能发生重组。

例雄果蝇和雌家蚕
P: 灰体长翅(BBVV) ×黑体残翅(bbvv)
↓
F1: 灰体长翅(BbVv) ♂×黑体残翅(bbvv) ♀
↓
灰体长翅(BbVv) : 黑体残翅(bbvv) =1 : 1
3、不完全连锁(Incomplete linkage)：
如测交2，基因可以发生部分重组，但亲本类型多于重组类型。

灰体长翅(BbVv) ♀×黑体残翅(bbvv) ♂
↓
灰体长翅: 黑体长翅: 灰体残翅: 黑体残翅
(BbVv) (bbVv) (Bbvv) ( bbvv)
4、互引相和互斥相
(1)相引是两个基因位于同一条染色体上，相斥则反之。

5、交换
1）.交换的机制：
Janssens, 1909：交叉型假设（chiasmatype hypothesis），
要点：
(1).减数分裂前期的双线期，非姊妹染色单体之间发生交换(crossing over)，出现交叉(chiasma)。

(2).相互连锁的两个基因之间如发生交换，会导致这两个基因发生重组。

发生过交换的性母细胞产生的配子，只有一半是重组子，另一半是亲组合型。

2）、交换率（crossover rate）：又称交换值或重组率(RF ，recombination frequency)。

交换率= [重组合∕(亲组合＋重组合)] 100％
单位:图距单位 m.u.（map unit）或厘摩（centimorgan，cM）
以玉米的测交实验为例说明交换率测定方法。

例： C与Sh连锁，亲本为互引相时（图）
C与Sh连锁，亲本为互斥相时（图）
分析：不论哪种基因组合的交配方式，测交后代中亲组合的频率都是97%左右（高），重组合的频率仅占3%左右（低）。

RF值越小，基因间的连锁强度越大。

RF值越大，基因间的连锁强度越小；接近50%时，基因间的连锁关系难以判断，必须用大量的测交后代的数据方可鉴别。

6、连锁群
连锁现象在生物界普遍存在。

连锁群(linkage group)：
连锁群的数目=单倍体染色体数(n)
人类=23 ，果蝇=4
7、连锁交换定律
摩尔根：遗传学第三大定律：连锁交换定律。

内容：处在同一染色体上的两个或多个基因联合在一起传入子代的频率大于重新组合的频率. 重组类型的产生是由于配子形成时，同源染色体的非姊妹染色单体间发生了局部交换的结果。

8、三大遗传定律的关系
1）．分离定律是自由组合定律和连锁交换定律的基础；
2）．自由组合定律和连锁交换定律是生物体遗传性状发生变异的主要机制；3）．自由组合与连锁交换的区别：
(1)染色体间重组(interchromosomal recombination)
染色体内重组(intrachromosomal recombination)
(2)自由组合受生物染色体对数的限制，而连锁交换则受其染色体本身长度的限制。

9. 影响交换的因素:
温度，射线和化学物质，着丝粒：性别等。

10. 霍尔丹定律
生理学及遗传学家J·B·S·Haldane（英）
凡是较少发生交换的个体必定是异配性别个体。

——霍尔丹定律。

在一定条件下，相同基因之间的交换值是相对稳定的。

11、双交换
双交换（double crossingover）
二、基因定位与染色体作图
基因在染色体上的位置是相对恒定的。

根据是两个基因之间的重组值(率)的相对恒定性。

不同基因间的重组值不同。

摩尔根(1911) ：重组值(交换值)的大小反映着基因座在染色体上距离的远近。

于是将交换的百分率直接定为染色体上基因座之间的距离单位。

A·H·Sturtevant ：“基因的直线排列”原理——任何3个距离较近的a、b、c连锁基因，若已分别测得a、b和b、c间的距离，那么a、c的距离，就必然等于前二者距离的和或差。

(一).基因直线排列原理及相关概念
基因直线排列原理：
1·基因定位(gene mapping)
2·染色体图(chromosome map)
3·图距(map distance) 图距单位(map unit，mu)：“厘摩”(centimorgan, cM)，lcM=l%重组值去掉%的数值。

(二).染色体作图
1. 两点测交(two-point testcross)（图）
1). 测交并计算重组值：
bi-w: 5.3cM
w-y: 1.1 cM
(1) w-y-bi
(2) y-w-bi
y-bi: 5.5 cM
2). 画出基因连锁图。

2. 三点测交(three-point testcross)
Morgan 和Sturtevant：
三点测交:用3个基因的杂合体abc/+++与3个基因的隐性纯合体abc/abc 做测交。

以下用实验说明其遗传分析的方法：（图）
ec-ct间的重组值是18.4%，但不等于ec-cv及间cv-ct间两个重组值分量之和，即10.2%+8.4%=18.6%=/=18.4%。

这究竟为什么?换言之，根据计算得知的ec-ct重组值为什么低于ec-cv及间cv-ct间重组值的两个分量之和?是否直线排列原理有误?回答是否定的。

因为在双交换类型中，末端两个基因(在此为ec 和ct)之间虽然同时发生了两次交换，但看不到重组，对于ec-ct来讲，双交换的结果等于不交换。

只有当基因cv存在时，才能从表型上辨认出双交换。

我们应该注意到，测交实验申有8个个体，(+++和ec ct cv)属于双交换的产物，在计算ec-cv的重组值和计算cv-ct的重组值时两次都利用了这个数值，可是计算ec-ct的重组值时却没有把它计算在内，因为它们间双交换的结果并不出现重
组。

所以ec-ct之间的实际交换值应当是重组值加2倍双交换值。

即
18.4%+2x0.1%-18.6%。

而在相邻的基因座(ec-cv，cv-ct)中的交换发生了重组，所以重组值代表了交换值。

对ec-ct的交换值作上述校正之后，它们之间的图距就是18.6cM，正好等于 ec-cv和cv-ct图距之和。

因此当三点测交后代出现8种表型时，表明相距较远的末端两个基因间必定有双交换发生，而末端两基因间的重组值往往会低估了交换值，此时需要用两倍双交换值来作校正。

若相距较近的3个基因的三点测交，往往不出现双交换类型，测交后代只有6种表型，无需校正。

3. 干涉和并发率
1）. 干涉(interference, I)在上述三点测交中，我们已经看到，双交换频率很低，这就是说中间一个基因跟它两侧的两个基因同时分开的机会很小。

一般双交换的发生率往往比预期的还少。

预期的双交换率应是两个单交换率的乘积，在上述例子里ec-ct基因间的双交换的预期频率应是10.2%X8.4%=0.86%。

但是观察到的双交换率只有 (5+3)/5318=0.15%。

可见每发生一次单交换都会影响它邻近发生另一次单交换，这种现象称作干涉(interference，I)或染色体干涉(chromommeintedepence)。

2）.正干涉和负干涉：第一次交换发生后，引起邻近发生第二次交换机会降低的情况称为正干涉(positive interference) ，引起第二次交换机会增加的为负干涉(negative interference) 。

3）.并发系数(coefficient of cincidence)
一般用并发系数来表示干涉作用的大小, 观察到的双交换率与预期的双交换率的比值称做并发系数(coefficient of coincidence，C)。

（图）所以干涉I=l-C。

并发系数愈大，干涉作用愈小，并发系数C=l时，I=0, 表示没有干涉，反之I=1表示干涉是完全的，三点测交实验没有观察到双交换，后代中只出现6种表型，这一般是由于基因间相距很近，以致双交换不易发生。

上述实验中可以计算出C=0.15%/ 0.86% =0.17。

所以I=1-C=1-0.17=0.83或83%，这意味着83%的双交换被干涉掉了。

遗传学家们已经利用上述同样的方法，绘制了果蝇的4个连锁图和玉米的10个连锁图。

玉米的染色体图
关于遗传学图的补充说明:
(1).一般以最左瑞的基因位置为0,但随着研究的进展，发现有新的基因在更左端的位置时，把0点的位置让给新的基因，其余的基因座作相应的移动。

(2). 重组率在0%-50%之间，但在遗传学图上可以出现50个单位以上的图距。

这是因为这两个基因之间距离较远，发生多次交换的缘故，但实际上它们之间的重组率不会超过50%。

例如果蝇X染色体上y基因与r基因间的图距是57.6cM，但实际上y-r间的重组率不会超过50%，所以由实验得到的重组率与图上的数值不相一致。

从而要从图上数值得知基因之间的重组率只限于邻近的基因座间。

相距较远基因之间的重组率要通过测交才能得知。

第二节真菌的遗传分析
一. 链孢霉（Neurospora crassa）的生活史
分生孢子(conidia)
交配型（matig type）
子囊果(peri thecium)子实体
子囊(ascus)
子囊孢子(ascospore)
链孢霉的生活史
粗糙链孢霉和酵母菌等都是真菌，属于低等真核生物，其特点是：
(1).子囊孢子是单倍体，无显隐性复杂性，表型直接反映基因型。

(2).一次只分析一个减数分裂的产物。

(3).体积小，易增殖，易培养，一次杂交可以产生大量后代，易于获得正确的统计结果。

(4).进行有性生殖，染色体的结构和功能类似于高等动、植物。

粗糙脉孢菌的营养菌丝体是分节的，每一节内含有许多单倍体的核，它的每一节都有不成对的7条染色体。

野生型粗糙脉孢菌的分生孢子萌发，菌丝生长，形成菌丝体，菌丝再长出分生孢子散开去，继续无性繁殖周期。

无性生殖
两种不同的接合型相互结合:一种接合型菌株(A)的分生孢子落在另一种接合型菌株(a)的子实体的受精丝上。

其细胞核进人受精丝中，形成异核体。

经多次有丝分裂，两种细胞核在子囊(ascus)中融合成合子核(2n)。

接着合子核在子囊中进行减数分裂，每一个二倍体核产生4个单倍体核。

每一单倍体又进行一次有丝分裂，使每一成熟的子囊中含有8个子囊孢子，其中邻接的每一对孢子有相同的基因型。

有性生殖:
3、脉孢霉减数分裂（图）
二. 顺序四分子及其遗传分析
1、顺序四分子
1）四分子(tetrad): 一个性母细胞减数分裂的四个产物（子代个体）留在一起.
四分子分析(tetrad analysis):对四分子进行遗传学分析.
顺序四分子(ordered tetrad): 链孢霉的减数分裂的四个产物（子代链孢霉）不仅留在一起，而且以直线方式顺序排列在子囊中。

脉孢菌减数分裂的4个产物保留在一起，称为四分子(tetrad)，但是，子囊的外形是如此狭窄，以致分裂的纺锤体不能重叠，只能纵立于它的长轴之中，这样一来，所有分裂后的核——8个子囊孢子都从上到下顺序排列成行，可以推知，第一对子囊孢子来自一条染色单体，第二对孢子则是来自这条染色单体的姊妹染色单体;第三和第四对子囊孢子是来自前一条染色体同源染色体的姊妹染色单体。

所以，脉孢菌减数分裂所产生的四分子是属于顺序四分子(orded tetrad)。

顺序四分子在遗传分析上有很多优越性:
(1)可以把着丝粒作为一个座位(locus)，计算基因与着丝粒的重组率，即着丝粒作图。

(2)子囊中子囊孢子的对称性，证明减数分裂是一个交互过程。

(3)可以检验染色单体的交换有否干涉现象，还可利用它来进行基因转变(gene conversion)的研究。

(4)证明双交换不仅可以包括4线中的两线而且可以包括3线或4线
利用四分子分析法，测定基因与着丝粒间的距离称为着丝粒作图。

问题：高等动植物中能否用着丝粒作图来确定某基因在染色体上的位置？
2. 着丝粒作图(centromere mapping)
1）.第一次分裂分离( first-division segregation , MI)
如果着丝粒与某杂合基因座之间没有发生交换，则减数分裂中，等位基因A 和a的分离发生在第一次减数分裂期间。

（图）
2).第二次分裂分离( Second-division segregation , MII)
如果着丝粒与某杂合基因座之间发生了交换，则减数分裂中，等位基因A
和a的分离发生在第二次减数分裂期间。

第一次分裂分离: ＋＋－－
－－＋＋
第二次分裂分离: ＋－＋－
＋－－＋
－＋＋－
－＋－＋
3). 着丝粒作图(Centromere mapping)
利用四分子分析法，测定基因与着丝粒间的距离，即根据子囊孢子基因型的排列顺序，计算基因与着丝粒的重组率，确定基因与着丝粒之间的距离和排列顺序。

实验说明：两种链孢霉杂交：
野生型菌株(lys+，或十)，子囊孢子：黑色。

赖氨酸缺陷型(lys—或—)，子囊孢子：灰色。

重组率= 交换型子囊数÷总子囊×1/2×100％
赖氨酸缺陷型(lys-) X 野生型(lys+)
序号子囊类型子囊数分裂类型
＋＋－－１０５ＭI
－－＋＋１２９非交换型
＋－＋－９
－＋－＋５ＭII
＋－－＋１０交换型
－＋＋－１６
根据子囊孢子的排列次序可有6种子囊型，只写出其中的4个孢子对(spore pairs)，结果为（图）：
3、连锁基因作图（链孢霉的连锁作图
nic（nicotinic）╳ad（adenine）
PD为亲二型（parental ditype）
NPD为非亲二型( nonparental ditype )
T为四型（tetratyne）
表： nic + × + ad 得到不同子囊型的后代
（1）（2）（3）（4）（5）（6）（7)
＋ ad ＋＋＋＋＋ ad ＋ ad ＋＋＋＋
＋ ad ＋＋＋ ad nic ad nic ＋ nic ad nic ad
nic + nic ad nic ＋＋＋＋ ad ＋＋＋ ad
nic + nic ad nic ad nic ＋ nic ＋ nic ad nic ＋
M1 M1 M1 M1 M1 M2 M2 M1 M2 M2 M2 M2 M2 M2 （PD）（NPD）（T）（T）（PD）（NPD）（T）
808 1 90 5 90 1 5
(1) 四分子类型的形成
(2). 计算着丝粒与基因n之间的重组率：
(3). 计算着丝粒与基因a之间的重组率：
（4）计算基因a、n之间的重组率：
（5）画出基因连锁图：
RF（着丝粒-nic）
=[(4)(5)(6)(7) ÷1000] × 1/2 × 100%
=[ (5+90+1+5) ÷1000]×1/2
= 5.05 % = 5.05 (m.u)
RF（着丝粒-ad）
= [(3) (5) (6) (7) ÷1000] × 1/2 × 100%
=[ (90+90+1+5) ÷1000]×1/2
= 9.30 % = 9.30 (m.u)
nic 和ad 这两个基因是否连锁 ?
RF(nic～ad)
= ( NPD+1/2 T) ÷总子囊数
={ [(2) + (6) ] + 0.5 [ (3) (4) (7)] } ÷ 1000
={ (1+1) + 0.5 ( 90+5+5 ) } ÷1000 = 5.2 %
= 5.2 (m.u.)
因亲组合(M1M1)约占80％，表明是连锁的；
第三节重组机理
一、基因转变
如前所述，重组通常总是交互的，如在一个杂合体Aa中，如果一染色体把基因A交给其同源染色体，则它的同源染色体必定把 a回交给它。

所以在真菌如链孢霉中，一个座位上的两等位基因分离时，应该呈现2：2分离，即野生型与突变型孢子为4：4分离。

1930年Winkler把真菌中不规则分离现象解释为基因转变（conversion） Lindegren,C.C（1949）报道了酵母有规律的异常分离现象：交配型A×a 的杂交中，有些子囊所含的孢子为（3A+1a），也称为基因转变。

50年代中期Mitchell,M. B. 发现了链孢霉中的异常分离，认为其不是由于整个染色体的异常行为，而是由于特定位点的“基因转变”所致，即属于基因内重组。

Olive, E1-Ani和Kitani等在粪壳菌（Sodaria fimicola）中也发现了异常分离。

认为这种异常分离是有丝分裂的产物，称为减数后分离（postmeiotic segreation）
Mitchell,M. B.的杂交实验：
两种吡哆醇（B6）合成营养缺陷型杂交（+ pdxp与pdx +杂交）（图）
585个子囊，其中4个特殊
可能的解释：
重组？！相反的重组子未出现。

突变？！其出现的概率比正常的突变率高的多。

正常2：2 异常3：1
基因转变往往伴有转换区外基因的重组，但区外基因的重组是正常的交互形式，所以虽然pdxp位点出现异常的3：1（或6：2）分离，但邻接的pdx位点仍显示正常的2：2分离。

在粪生粪壳菌中也发现此现象。

被广泛研究的是g基因，其决定子囊孢子的颜色（图）：
异常（0.08—0.06%）
此菌异常分离子代中，虽g+/g-呈现异常分离，但邻近的A/a基因仍呈现正常分离。

二、重组机制
（一）各种模型理论
1、交叉理论（chiasmatatype hypothesis）：1909年Janssens并提出了交叉型理论
2、断裂重接（愈合）模型：1937年Darlington提出
3、模板选择学说（copy choice ）：Belling J.首先提出的，1933年他又撤回了这一假设。

4、1948年Hershey提出模板选择学说
断裂重接模型和模板选择复制模型的否定
断裂重接模型不能解释基因转变和极化子现象
模板选择复制模型存在的问题：
(1) 违背了半保留复制；
(2) DNA复制应在S期，重组应在粗线期，不应同时发生。

(3)不能解释3线和4线交换。

二、Holliday 模型
极化子（polaron）：同一基因内部的各个突变位点的转变频率常从基因的一端向另一端逐步递减，具有这种现象的一段DNA称为极化子，一个极化子相当于一个基因（Rizet等1961）。

基因重组的模型都必须解释异源双链的形成以及基因转变往往伴随着两侧基因重组这一现象。

1964年美国学者Robin Holliday提出了著名的Holiday模型（图）
三、重组类型
（一）同源重组 (homologous recombination )或
普遍性重组（generalized recombination ）
（二）位点特异性重组(site-specific recombination)
如1、λ在att位点的整合
2、倒位重组：沙门氏细菌（Salmonella）的相转变
4、Mu噬菌体G片段的倒位
3、酵母交配型转变的重组
（三）非同源重组
如转座
四、转座
（一）原核生物的转座因子
1951年McClintock：转座（Transposition）跳跃基因(jumping gene)
1、原核生物中的转座因子的发现和检出
1967年Shapiro才在E.coli的半乳糖操纵子(gal K,T,E ）中发现了转座因子（transposable element）。

2．原核转座因子的类型
(1) 插入序列(IS)
(2) 复合转座子。

(3) TnA家族
(4)Mu噬菌体
3．转座机制
(1) 类型
a、复制型转座（replicative transposition）
b、非复制型转座（nonreplicative transposition）
c、保守转座（conservative tranposition）
4．转座的共同中间体
复制型转座模型解释了：
(1) 复制性转座在转座后原来的位置上保留原有的Tn；
(2) 在新位置上转座子的两端出现正向重复靶序列；
(3)转座过程中出现共合体。

Tn10的转座具有多项控制
1.“多拷贝抑制”（multicopy inhibition）
（1）Pout 比 Pin强得多；
(2) OUT RNA比IN RNA较为稳定。

(3) OUT RNA的功能是作为一种反义RNA，
2. 顺式优先(Cis-Preference)
3、dam甲基化
减少转座频率
把转座和复制叉的途径连系起来。

二、真核生物的转座因子
（一）、玉米中的控制因子
1938年Marcus Rhoades首次发现不稳定突变等位基因（unstable mutant allele），即一种回复突变率很高的等位基因。

不稳定是取决于不连锁的Dt基因的存在。

McClintock。

1940～1950描述了大量的控制因子
（二）．果蝇中的P因子
“杂种不育”（hybrid dysgenesis）。

P型（paternal contributing）
M型（maternal contributing）
M（♂）×P（♀）后代可育，
反交 P（♂）×M（♀）后代不育。

Corn kernel showing spot of colored aleurone produced by genetic trasposition involving the Ac-Ds system.
（三）反转录病毒和反转录子
1、．反转录病毒（retroviruses）
2、．酵母的Ty因子（transponson yeast）
第四节. 人类基因组和染色体作图
人们已经绘制出了人类各染色体的遗传图。

因为人的Y染色体上的基因数目很少，X染色体上的绝大多数基因都类似纯合子，因此通过性连锁遗传分析，已将X染色体上许多基因确定了彼此间的相对位置和距离。

人类基因组：30亿bp
70%单拷贝
30%重复序列
人类染色体: 22A+XY
人类基因组计划（human genome project, HGP）1991-2005 30亿
1.家系分析法(pedigree method)（图）
2.外祖父法（grandfather method）（图）
3.体细胞杂交法--人鼠融合细胞（图）
I号染色体和肽酶C
17号染色体和 TK
表：杂种细胞系的染色体和TK活性
细胞系人类染色体 TK活性
（1）5，9，12，21 －
（2）3，4，17，21 ＋
（3） 5，6，14，17，22 ＋
（4）3，4，9，18，22 －
（5）1，2，6，7，20 －
（6）1，9，17，18，20 ＋
表：克隆嵌板
4. 人类X染色体的连锁图（图）。