不同提取工艺制备的核桃蛋白的组成与结构特征

不同提取工艺制备的核桃蛋白的组成与结构特征
毛晓英;华欲飞
【摘要】The composition and structure characteristics of walnut proteins were investigated by different extracted techniques. The results show that the walnut protein contents are 90% by alkaline extractionisoelectric precipitation technique, and 70% by isoelectric precipitation technique, respectively. The secondary structure of highly ordered a-helix structure is damaged for some extent, while β-turn and disordered structure are increased. Subunits and amino acids of walnut protein by the extracted techniques are not damaged. The two extracted techniques show high protein yield with small damage to protein structure and components.%研究了碱溶酸沉工艺和酸沉工艺制备的核桃蛋白产品的组成和结构特征的变化.结果表明:碱溶酸沉工艺制备的产品蛋白质量分数高于90％,酸沉工艺制备的产品蛋白质量分数高于70％；2种制备蛋白质工艺使蛋白产品中的α-螺旋结构减少,β-转角和无规则卷曲结构大量增加,使核桃蛋白的NSI显著增加；2种工艺对核桃蛋白质的亚基组成无显著影响,对氨基酸破坏不显著.碱溶酸沉和酸沉2种制备工艺具有得率高、对蛋白质结构和组成破坏小等优点.
【期刊名称】《江苏大学学报（自然科学版）》
【年(卷),期】2011(032)006
【总页数】5页(P631-635)
【关键词】提取工艺;蛋白制备;核桃蛋白;组成;结构特征
【作者】毛晓英;华欲飞
【作者单位】江南大学食品科学与技术国家重点实验室,江苏无锡214122;石河子
大学食品学院,新疆石河子832003;江南大学食品科学与技术国家重点实验室,江苏
无锡214122
【正文语种】中文
【中图分类】TQ936.2
核桃 (Juglans regia L．)又名胡桃、羌桃，属胡桃科胡桃属植物，是一种营养价
值和经济价值都很高的珍贵果木．在我国，核桃栽培面积居世界首位［1］．除了核桃油，核桃仁含有18%～24%的蛋白质，12%～16%的碳水化合物，1.5%～2.0%的纤维素，1.7%～2.0%的矿物质［2］．由此可见，核桃的加工应主要以核
桃油和核桃蛋白为主．核桃蛋白作为一种新的植物蛋白资源，对其组成和结构的认知对核桃蛋白产品的开发和利用起着重要的作用．目前，国内关于核桃蛋白产品的研究主要以核桃粉、核桃多肽为主［3］，提取工艺简单，且未对其提取物组成和结构进行深入的研究．国外关于不同提取工艺制备的核桃蛋白产品的研究报道不多，关于核桃蛋白组成的研究也较少，主要集中在核桃蛋白组成和溶解性方面的研究［4］，且研究的不够深入．鉴于此，文中对不同提取工艺制备的核桃蛋白的化学组成、亚基组成、二级结构、氨基酸组成进行研究和分析，以期对今后核桃蛋白产品的加工提供参考．
1 材料与方法
1.1 材料与设备
核桃购于新疆石河子市农贸市场，为新疆簿皮核桃品种．试剂:正己烷，体积分数
95%乙醇等，分析纯，购于上海化学试剂有限公司．
设备:J6大容量冷冻离心机(美国贝克曼公司);LGJ－18型冷冻干燥机(北京四环科学有限公司);Water 2690型液相色谱系统(美国Waters公司);Jasco J－715圆二色
光谱仪(日本Jasco公司);DYY－8C型垂直电泳仪(北京六一仪器厂);WH－1微型漩涡混合仪(上海沪西分析仪器厂);TGL－16B高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)．1.2 方法
核桃仁的去皮参照文献［5］的方法．核桃脱脂粉的制备:将去皮的核桃仁烘干后经破碎机破碎，用正己烷在室温下进行脱脂处理3 h，核桃仁与正己烷的比例为0.1 g·mL－1;提取液用滤纸过滤，残渣再次进行正己烷的脱脂处理，直到滤液为无色
为止;收集残渣将其置于通风厨挥干溶剂;将脱脂粉过150目筛，装袋，置于－20℃备用．
碱溶酸沉法提取蛋白工艺流程:核桃脱脂粉—95%醇洗—过滤得滤饼—挥干溶剂—蛋白质溶液调蛋白液pH为11—搅拌1 h—离心(5 000 r·min－1，15 min，25℃)—上清液—调pH为4.5—搅拌1 h—离心(5 000 r·min－1，15 min，
25 ℃)—沉淀—水洗至中性—冻干．
酸沉法提取工艺流程:核桃脱脂粉—95%醇洗—过滤得滤饼—挥干溶剂—蛋白质溶液—调蛋白液 pH 为 4.5—搅拌 1 h—离心(5 000 r·min－1，15 min，25℃)—沉淀—水洗至中性—冻干．
原料常规成分的测定:水分，粗脂肪，蛋白质以及灰分的测定参照文献［3］的方法，碳水化合物的测定参照文献［6］的方法．蛋白质溶解度(NSI)的测定:将蛋白样品
分散于去离子水中，磁力搅拌1 h后在室温条件下8 000 r·min－1，离心15 min;随后采用微量凯氏定氮法测定上清液中可溶解氮含量，蛋白质的溶解度(NSI)表示
为可溶解氮与样品中总氮的百分比．
蛋白质亚基组成分析采用十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法，
参照文献［7］的不连续电泳方法，略改．分离胶质量浓度125 g·L－1，浓缩胶质量浓度40 g·L－1，电极缓冲液含0.05 mol·L－1 Tris，0.384 mol·L－1甘氨酸，1 g·L－1 SDS(pH8.3)，用样品溶解液配制成蛋白质量浓度为2 g·L－1的电泳样品(分别为含巯基乙醇和不含巯基乙醇)．
蛋白质氨基酸组成分析采用液相色谱分析法(RP-HPLC)，参照文献［8］的方法，略改．采用液相色谱仪测定氨基酸的含量．色谱条件:仪器:安捷伦液相色谱仪(AG1100)，美国安捷伦公司;色谱柱:ODSHYPERSIL，250 mm ×4.6 mm，5 μm;柱温:40℃;流速:1.0 mL·min－1;检测器:紫外检测器．
蛋白质二级结构的分析采用远紫外CD光谱法，参照文献［9］的方法，略改．将蛋白样品分散于去离子水中，磁力搅拌2 h后在室温下8 000 r·min－1，离心10 min，采用BCA法以牛血清白蛋白为标准蛋白，测定上清液中蛋白质量浓度，最后通过稀释使得上清液中蛋白质量浓度达到5×10－5 g·mL－1．采用Jasco J－715 CD光谱仪在25°C条件测定核桃蛋白样品在190～250 nm之间的远紫外CD光谱．扫描3次取平均值得到最后CD光谱，最后以平均摩尔椭圆率θ表示，单位，(°)·cm2·dmol－1．
数据处理与分析:所有的测定目标至少测定3次以上，试验数据以均值±标准偏差的形式表示．
2 结果与讨论
2.1 不同提取工艺制备的核桃蛋白常规成分分析
不同提取工艺制备的核桃蛋白主要成分见表1．由表1可以看出，脱脂核桃粉的蛋白质量分数为52.51%，粗脂肪为1.81%，结果说明采用正己烷脱脂处理可以有效脱除大量的核桃油．碱溶酸沉工艺制备的核桃蛋白其蛋白质量分数为90.50%，得率为43.15%．而酸沉工艺制备的核桃蛋白其蛋白质量分数为75.56%，得率为76.60%．结果说明碱溶酸沉工艺可制备蛋白质量分数高于90%的核桃分离蛋白产
品;酸沉工艺可制备蛋白质量分数高于70%的核桃浓缩蛋白产品．
表1 不同提取工艺制备的核桃蛋白主要成分Tab．1 Com ponents of walnut proteins extracted by different techniques %ω得率脱脂粉(脱脂) 52.51±0.33 1.80±0.12 1.94±0.02 9.20±0.02 34原料(处理方法)NSI蛋白质粗脂肪灰分水
分碳水化合物.55±0.16 4.85±0.12蛋白(碱溶酸沉) 90.50±0.45 0.23±0.04
2.27±0.03 4.50±0.03 2.50±0.03 29.06±0.23 4
3.15蛋白(酸沉) 75.56±0.35
0.27±0.06 2.04±0.02 4.48±0.04 17.65±0.07 28.24±0.18 76.60
2.2 不同提取工艺制备的核桃蛋白的二级结构
蛋白质的二级结构是指多肽链骨架中局部肽段的构象，α-螺旋和β-折叠结构中存
在较多的氢键，导致规则二级结构具有一定的刚性;β-转角以及无规卷曲中不存在
氢键或其他的相互作用，使肽段中的各个残基间有更大的自由度，没有刚性，从而表现出极大的柔性．蛋白质分子中α-螺旋、β-折叠的稳定性主要取决于分子内部
的氢键．蛋白质分子中氢键是其中一个氨基酸残基上的氢原子与另一个氨基酸残基上的氧原子由于静电引力而形成．
核桃脱脂粉和不同提取工艺制备的核桃蛋白的CD图谱见图1．
图1 不同提取工艺制备的核桃蛋白的CD图谱Fig．1 CD spectrogram ofwalnut proteins extracted by different techniques
由图1可以看出，核桃脱脂粉和不同提取工艺制备的核桃蛋白的CD图谱负峰峰
形基本一致．核桃脱脂粉具有典型的α-螺旋结构的谱图，在201和221 nm有2个负的肩峰谱带．碱溶酸沉工艺制备的核桃分离蛋白在204和229 nm有负肩峰，其负峰位发生了红移．酸沉工艺制备的核桃浓缩蛋白在199和221 nm有2个负
的肩峰谱带，说明2种提取工艺制备的核桃蛋白产品的二级结构发生了改变．通
过软件分析二级结构数据(见表2)可知，核桃脱脂粉主要以α-螺旋结构为主，占80.4%．
表2 核桃蛋白的CD光谱二级结构分析Tab．2 Secondary structure of walnut proteins in CD spectra %原料α螺旋β折叠β 80.4±0.1 4±0.4 5.7±0.2
15.3±1.1核桃分离蛋白34.9±0.111±0.3 23.3±0.3 32±0.9核桃浓缩蛋白转角
无规则卷曲核桃脱脂粉34.7±0.1 11.2±0.2 23.2±0.2 31.6±0.1
碱溶酸沉工艺制备的核桃分离蛋白主要以α-螺旋和无规则卷曲为主，分别占
34.9%，32%，β-折叠结构有所增加．酸沉工艺制备的核桃浓缩蛋白主要以α-螺
旋和无规则卷曲为主，分别占34.7%，31.6%，β-折叠结构有所增加．由此结果
可以看出，碱溶酸沉和酸沉2种蛋白制备工艺对核桃蛋白质的二级结构产生了影响，其中α-螺旋结构受到一定程度的破坏，β-转角和无规则卷曲结构显著增加，
β-折叠少量增加．说明碱溶酸沉和酸沉工艺在蛋白制备的过程中破坏了蛋白质中
的氢键．此外，核桃脱脂粉的NSI为4.85%，碱溶酸沉工艺制备的核桃分离蛋白
的NSI为29.06%，酸沉工艺制备的核桃浓缩蛋白的NSI为28.24%，可以推断，碱溶酸沉和酸沉工艺破坏了核桃蛋白质分子中的氢键，从而增大了蛋白质分子的柔性，使核桃蛋白的NSI显著增加．
2.3 不同提取工艺制备的核桃蛋白的亚基组成
不同提取工艺制备的核桃蛋白的SDS-PAGE电泳图谱见图2(图中M:标准蛋白分子;泳道1:酸沉法提取工艺制备的核桃浓缩蛋白;泳道2:碱溶酸沉法工艺制备的核桃分离蛋白;泳道3:核桃脱脂粉)．由图2可以看出，碱溶酸沉工艺制备的核桃分离蛋白、酸沉工艺制备的核桃浓缩蛋白与核桃脱脂粉的亚基组成及多肽差异不大．在不加巯基乙醇的条件下电泳图谱显示至少有10个条带，其中染色最重的有6个条带，亚基相对分子质量分别为:110×103，70 ×103，55 ×103，40 ×103，35 ×103，20 ×103．在加入巯基乙醇的条件下电泳图谱显示有至少10个条带，其中染色最重的有4个条带，其多肽分子量分别为:40 × 103，35 × 103，23 × 103，20 × 103．对比图2a，b，结果显示，110 ×103亚基消失，70 ×103，55 ×103的亚
基颜色变淡，说明110×103，70×103和55×103的亚基由多肽组成．40×103
和35×103的亚基颜色加深，说明110×103和70×103的亚基由相对分子质量
为40×103和35×103的多肽构成．20×103的亚基颜色加深，说明相对分子质
量为40×103的亚基被β-巯基乙醇还原后变成20×103的肽链，且产生了
23×103的多肽．
图2 不同提取工艺制备的核桃蛋白的SDS-PAGE电泳图谱Fig．2 SDS-PAGE profiles ofwalnut proteins extracted by different techniques．
综上所述，碱溶酸沉工艺和酸沉工艺制备蛋白质的方法对核桃蛋白质的亚基组成无显著影响．核桃分离蛋白和核桃浓缩及核桃脱脂粉的相对分子质量范围为大约为(110～20)×103，包含6个亚基，4条多肽链，其中相对分子质量为70×103和
40×103的亚基由分子量为35×103和20×103的多肽通过二硫键连接．二硫键
的存在可能是核桃蛋白质NSI比较低的原因之一．
2.4 不同提取工艺制备核桃蛋白的氨基酸组成
不同提取工艺制备核桃蛋白的氨基酸组成见表3．由表3可以看出，碱溶酸沉工艺制备核桃分离蛋白与酸沉制备核桃浓缩蛋白除苏氨酸(Thr)和苯丙氨酸(Phe)的含量少量降低外，其他必需氨基酸含量均较核桃脱脂粉有少量的增加．此外，谷氨酸含量降低比较明显．由此结果说明碱溶酸沉工艺和酸沉工艺对核桃蛋白产品的氨基酸破坏不显著，尤其对于胱氨酸和蛋氨酸等含硫氨基酸影响不大．对照
FAO/WHO(1990)推荐必需氨基酸标准，核桃分离蛋白、核桃浓缩蛋白、核桃脱
脂粉的第一限制性氨基酸为赖氨酸(Lys)，第二限制性氨基酸为蛋氨酸(Met)．赖氨酸为第一限制性氨基酸这一研究结果与腰果、松子、榛子等油料仁的研究结果一致．相比之下，大豆分离蛋白的赖氨酸含量远远高于核桃蛋白［10］．除蛋氨酸(Met)外，碱溶酸沉工艺制备的核桃分离蛋白、酸沉工艺制备的核桃浓缩蛋白与核桃脱脂粉的7种必需氨基酸含量均高于FAO/WHO(1990)适用于成年人的推荐值．
表3 不同提取工艺制备核桃蛋白的氨基酸组成Tab．3 Am ino acid composition of walnut proteins extracted by different techniques g/100 g 氨基酸核桃脱脂粉核桃分离蛋白核桃浓缩蛋白FAO/WHO(1990)推荐婴幼儿成年人Asp 10.04±0.43 9.96±0.13 9.49±0.21 Glu 22.16±0.40 20.69±0.22 21.56±0.13 Ser 5.84±0.12 5.47±0.15 5.40±0.16 His 2.38±0.26 2.44±0.17
2.59±0.21 1.9 1.6 Gly 5.43±0.07 4.44±0.13 4.84±0.09 Thr
3.58±0.20
3.50±0.21 3.49±0.18 3.4 0.9 Arg 1
4.73±0.42 1
5.72±0.31 15.35±0.28 Ala
4.74±0.19 4.56±0.22 4.53±0.16 Tyr 2.76±0.11 3.41±0.17 3.14±0.16 Cys 0.84±0.08 0.86±0.03 0.95±0.04 Val 4.18±0.14 4.90±0.18 4.78±0.13 3.5 1.3 Met 1.16±0.12 1.53±0.15 1.35±0.18 2.5 1.7 Phe 4.94±0.23 4.89±0.22
4.77±0.20 6.3 1.9 Ile 3.28±0.15 4.24±0.18 4.14±0.14 2.8 1.3
续表氨基酸核桃脱脂粉核桃分离蛋白核桃浓缩蛋白FAO/WHO(1990)推荐婴幼儿成年人Leu 7.13±0.12 7.74±0.20 7.70±0.18 6.6 1.9 Lys 2.58±0.12
2.26±0.17 2.74±0.15 5.8 1.6 Pro 4.22±0.29
3.38±0.19 3.19±0.22
3 结论
碱溶酸沉工艺制备的核桃蛋白其蛋白质量分数为90.50%，得率为43.15%;而酸沉工艺制备的核桃蛋白其蛋白质量分数为75.56%，得率为76.60%．碱溶酸沉和酸沉2种蛋白制备工艺使核桃蛋白质的二级结构发生了变化，α-螺旋结构受到一定程度的破坏，β-转角和无规则卷曲结构显著增加，β-折叠少量增加，说明蛋白质中的氢键受到了破坏，这也引起了核桃蛋白的NSI显著增加．碱溶酸沉工艺和酸沉工艺制备蛋白质的方法对核桃蛋白质的亚基组成无显著影响．碱溶酸沉工艺制备核桃分离蛋白与酸沉制备核桃浓缩蛋白除苏氨酸(Thr)和苯丙氨酸(Phe)的含量少量降低外，其他必需氨基酸含量均较核桃脱脂粉有少量的增加．此外，谷氨酸含量降低比较明显．除蛋氨酸(Met)外，碱溶酸沉工艺制备的核桃分离蛋白、酸沉工艺制
备的核桃浓缩蛋白与核桃脱脂粉的7种必需氨基酸含量均高于FAO/WHO(1990)适用于成年人的推荐值．
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