动物组织DNA提取最终
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动物组织DNA提取
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一 二 三 四
Contents
实验原理及目的 实验方法及一般步骤
实验中注意事项 实验中常见问酸)
主要存在于细胞核的染色体中。 核外也有少量DNA，如线粒体DNA（mtDNA），叶绿体DNA
（cpDNA），质粒DNA。
⑤ 加辅助物，促进沉淀
⑥ 洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出 ，勿倾倒
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提取
III.核酸分离、纯化
纯化
IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质
V.核酸溶解在适量缓冲液或水中
二、实验方法及一般步骤
1）破碎细胞（防止核酸酶的作用）
微生物：溶菌酶、SDS裂解。 高等植物：捣碎器破碎、液氮研磨。
酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶， 冰冻法：反复冻融或液氮冻后组织捣碎。 动物：液氮处理后用匀浆器或者研钵破碎。 细胞器DNA：首先纯化细胞器。
❖ 浓度的测定
❖ 分光光度计测定
❖ 纯度的评定
❖ 一般用OD260/OD280值检测样品的纯度。正常OD260/OD280值约为1.7-1.9，说明 DNA纯度较好；若小于1.7可能有蛋白污染；若大于2.0，说明有RNA污染或DNA已经 降解。
❖ 注意：因为PH和离子会影响光吸收值，因此洗脱时如不使用洗脱缓冲液，而是用去离 子水， OD260/OD280值会偏小，但并不表示纯度低。
二、实验方法及一般步骤
4）核酸样品的保存
核酸保存的主要条件是温度和介质
温度： 4℃ 样品经常使用 -70℃是长期保存的良好温度，为一次性保存 -20℃保存,避免反复冻融
保存介质： 灭菌水 TE缓冲溶液(最常用)： 10mmol/L Tris-Cl pH8.0 1mmol/L EDTA pH8.0
用紫外分光光度计检测DNA浓度与纯度
• TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase • pH值为8.0，可防止DNA发生酸解
四、 DNA提取常见问题
问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。
原 因
① DNA中含有蛋白、 多糖、多酚类杂质
② DNA在溶解前，有
酒精残留，酒精抑 对
制后续酶解反应
策
③ DNA中残留有金属 离子
问题三：DNA提取量少 ① 尽量选用新鲜（幼嫩）的材料
原 因
① 实验材料不佳或量少
② 破壁或裂解不充分 对
③ 沉淀不完全
策
④ 洗涤时DNA丢失
② 动植物要匀浆研磨充分；细菌、酵 母裂解前先用生物酶或机械方式破 壁
③ 高温裂解时，时间适当延长（对于 动物细胞、细菌可增加PK的用量）
④ 低温沉淀，延长沉淀时间
➢ 离心分离两相时，应保证一定的转速和时间
➢ 针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相 应的去杂质的方法
三. 注意事项——核酸沉淀、溶解
➢ 当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分 ➢ 沉淀时加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀 ➢ 沉淀后应用70％的乙醇洗涤，以除去盐离子等 ➢ 晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥） ➢ 若长期储存建议使用TE缓冲液溶解
溶菌酶：破碎细胞
二、实验方法及一般步骤
1、核酸制备的一般原则 核酸的理化性质
在细胞内通常与蛋白质结合，以复合物形式存在 微溶于水，不溶于乙醇，氯仿等有机溶剂 在酸性溶液中容易降解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。 DNA溶液粘度很大，RNA的粘度较小 在强大离心力的作用下，可以从溶液中沉降下来
二、实验方法及一般步骤
核酸制备时应注意的事项:
①尽量简化操作步骤，缩短提取过程。 ②减少化学因素对核酸的降解。 ③减少物理因素对核酸的降解：机械剪切力和高温 ④防止核酸的生物降解：排除核酸酶。
二、实验方法及一般步骤
3. 核酸制备的一般步骤：
I.材料准备
破碎组织细胞
II.破碎细胞或包膜－内容物释放
① 尽量取新鲜材料，低温保存材料避 免反复冻融
② 液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻 前加入裂解缓冲液
③ 在提取内源核酸酶含量丰富的材料 的DNA时，可增加裂解液中螯合剂 的含量
④ 细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔 ⑤ 所有试剂用无菌水配制，耗材经高
温灭菌 ⑥ 将DNA分装保存于缓冲液中，避免
反复冻融
五、 DNA提取常见问题
❖ 蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸 二钠）存在下保持很高的活性。在匀浆后提取DNA的反应 体系中，SDS可破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA 分离，EDTA则抑制细胞中Dnase的活性；而蛋白酶K可将 蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来 。
一、实验原理及目的
二、实验方法及一般步骤
2、核酸制备的一般原则
分离纯化核酸总的原则：
1 保证DNA结构的完整性 2纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质 3排除有机溶剂和金属离子的污染 4蛋白质多糖分类等降低到最低程度 5排除其他核算分子的污染
核酸纯化应达到的要求：
①核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子； ②其它生物大分子的污染应降低到最低程度； ③排除其它核酸分子的污染。
以上处理时均要同时加入核酸酶抑制剂
二、实验方法及一般步骤
2）破碎抽提核酸除去杂质
➢ 首先使脱氧核糖核蛋白、核糖体、病毒的核蛋白与其它 成分分离
➢ 使核酸与蛋白质分离 ➢ 除去脂类 ➢ 多糖的除去
二、实验方法及一般步骤
3）核酸的纯化
根据所需核酸的性质和特点除去其它核酸污染, 并除去提取过程中的系列试剂(盐、有机溶剂等） 杂质，最后得到均一的核酸样品。
❖ 提取DNA主要是对基因和基因组进行分析。 ❖提取RNA主要是为了对基因表达实验方法及一般步骤
目前从样品中分离DNA的方法主要有两种， 分为CTAB法和SDS法（表面活性剂，能溶解细 胞膜和核膜蛋白，是核蛋白解聚，从而使DNA得 以游离出来）。
RNA（核糖核酸）
存在于细胞质中，如mRNA, rRNA, tRNA等。
除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病毒和噬菌 体，其或只含DNA，或只含有RNA。
一.实验原理及目的
❖ 2、真核生物的一切有核细胞（包括培养细胞）都能用来 制备基因组DNA。真核生物的DNA是以染色体的形式存在 于细胞核内，因此，制备DNA的原则是既要将DNA与蛋白 质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。提取 DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含SDS（十二烷 基硫酸钠）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚 和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇 沉淀使DNA从溶液中析出。
三. 注意事项——材料准备
➢ 最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要 反复冻融
➢ 提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞 （白细胞）
➢ 细胞培养时间不能过长，否则会造成DNA降 解
➢ 含病毒的液体材料DNA含量较少，提取前先 富集
3. 注意事项——细胞裂解
➢ 材料应适量，过多和过少会造成裂解不彻底， 导致DNA量少，纯度低。
➢ 针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：
• 植物材料－－液氮研磨 • 动物组织－－匀浆或液氮研磨 • 组培细胞－－蛋白酶K • 细菌－－溶菌酶破壁
➢ 高温温浴时，定时轻柔振荡
三. 注意事项——核酸分离、纯化
➢ 采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提 供相应的缓冲体系
➢ 采用有机溶剂（酚/氯仿）抽提时应充分混匀， 但动作要轻柔
二、实验方法及一般步骤
核酸制备中常用的去垢剂
核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。用于核酸 提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂。 去垢剂的作用： 1．溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂； 2．溶解核糖体上面的蛋白质，使其解聚，将核酸释放出 来； 3．对RNase、DNase有一定的抑制作用。
如：SDS、脱氧胆酸钠、4-氨基水杨酸钠、萘-1.5-二磺酸钠、 三异丙基萘磺酸钠
① 重新纯化DNA，去 除蛋白、多糖、多酚 等杂质
② 重新沉淀DNA，让 酒精充分挥发
③ 增加70％乙醇洗涤 的次数（2-3次）
五、 DNA提取常见问题
问题二：DNA降解
原
因
① 材料不新鲜或反复冻
融
② 未很好抑制内源核酸 对
酶的活性 ③ 提取过程操作过于剧
策
烈，DNA被机械打断
④ 外源核酸酶污染
⑤ DNA样品反复冻融
二、实验方法及一般步骤
核酸制备中常用的蛋白质变性剂
作用： 1.使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造
成蛋白污染。
2.使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸。
3.某些蛋白质变性剂也有抑制 RNase活性和破裂细胞的作用。 如：苯酚、氯仿、盐酸胍、DEPC
二、实验方法及一般步骤
核酸制备中常用的酶 DNase:降解DNA RNase：降解RNA 蛋白酶K：降解蛋白质
动物组织DNA提取
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一 二 三 四
Contents
实验原理及目的 实验方法及一般步骤
实验中注意事项 实验中常见问酸)
主要存在于细胞核的染色体中。 核外也有少量DNA，如线粒体DNA（mtDNA），叶绿体DNA
（cpDNA），质粒DNA。
⑤ 加辅助物，促进沉淀
⑥ 洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出 ，勿倾倒
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提取
III.核酸分离、纯化
纯化
IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质
V.核酸溶解在适量缓冲液或水中
二、实验方法及一般步骤
1）破碎细胞（防止核酸酶的作用）
微生物：溶菌酶、SDS裂解。 高等植物：捣碎器破碎、液氮研磨。
酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶， 冰冻法：反复冻融或液氮冻后组织捣碎。 动物：液氮处理后用匀浆器或者研钵破碎。 细胞器DNA：首先纯化细胞器。
❖ 浓度的测定
❖ 分光光度计测定
❖ 纯度的评定
❖ 一般用OD260/OD280值检测样品的纯度。正常OD260/OD280值约为1.7-1.9，说明 DNA纯度较好；若小于1.7可能有蛋白污染；若大于2.0，说明有RNA污染或DNA已经 降解。
❖ 注意：因为PH和离子会影响光吸收值，因此洗脱时如不使用洗脱缓冲液，而是用去离 子水， OD260/OD280值会偏小，但并不表示纯度低。
二、实验方法及一般步骤
4）核酸样品的保存
核酸保存的主要条件是温度和介质
温度： 4℃ 样品经常使用 -70℃是长期保存的良好温度，为一次性保存 -20℃保存,避免反复冻融
保存介质： 灭菌水 TE缓冲溶液(最常用)： 10mmol/L Tris-Cl pH8.0 1mmol/L EDTA pH8.0
用紫外分光光度计检测DNA浓度与纯度
• TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase • pH值为8.0，可防止DNA发生酸解
四、 DNA提取常见问题
问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。
原 因
① DNA中含有蛋白、 多糖、多酚类杂质
② DNA在溶解前，有
酒精残留，酒精抑 对
制后续酶解反应
策
③ DNA中残留有金属 离子
问题三：DNA提取量少 ① 尽量选用新鲜（幼嫩）的材料
原 因
① 实验材料不佳或量少
② 破壁或裂解不充分 对
③ 沉淀不完全
策
④ 洗涤时DNA丢失
② 动植物要匀浆研磨充分；细菌、酵 母裂解前先用生物酶或机械方式破 壁
③ 高温裂解时，时间适当延长（对于 动物细胞、细菌可增加PK的用量）
④ 低温沉淀，延长沉淀时间
➢ 离心分离两相时，应保证一定的转速和时间
➢ 针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相 应的去杂质的方法
三. 注意事项——核酸沉淀、溶解
➢ 当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分 ➢ 沉淀时加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀 ➢ 沉淀后应用70％的乙醇洗涤，以除去盐离子等 ➢ 晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥） ➢ 若长期储存建议使用TE缓冲液溶解
溶菌酶：破碎细胞
二、实验方法及一般步骤
1、核酸制备的一般原则 核酸的理化性质
在细胞内通常与蛋白质结合，以复合物形式存在 微溶于水，不溶于乙醇，氯仿等有机溶剂 在酸性溶液中容易降解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。 DNA溶液粘度很大，RNA的粘度较小 在强大离心力的作用下，可以从溶液中沉降下来
二、实验方法及一般步骤
核酸制备时应注意的事项:
①尽量简化操作步骤，缩短提取过程。 ②减少化学因素对核酸的降解。 ③减少物理因素对核酸的降解：机械剪切力和高温 ④防止核酸的生物降解：排除核酸酶。
二、实验方法及一般步骤
3. 核酸制备的一般步骤：
I.材料准备
破碎组织细胞
II.破碎细胞或包膜－内容物释放
① 尽量取新鲜材料，低温保存材料避 免反复冻融
② 液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻 前加入裂解缓冲液
③ 在提取内源核酸酶含量丰富的材料 的DNA时，可增加裂解液中螯合剂 的含量
④ 细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔 ⑤ 所有试剂用无菌水配制，耗材经高
温灭菌 ⑥ 将DNA分装保存于缓冲液中，避免
反复冻融
五、 DNA提取常见问题
❖ 蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸 二钠）存在下保持很高的活性。在匀浆后提取DNA的反应 体系中，SDS可破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA 分离，EDTA则抑制细胞中Dnase的活性；而蛋白酶K可将 蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来 。
一、实验原理及目的
二、实验方法及一般步骤
2、核酸制备的一般原则
分离纯化核酸总的原则：
1 保证DNA结构的完整性 2纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质 3排除有机溶剂和金属离子的污染 4蛋白质多糖分类等降低到最低程度 5排除其他核算分子的污染
核酸纯化应达到的要求：
①核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子； ②其它生物大分子的污染应降低到最低程度； ③排除其它核酸分子的污染。
以上处理时均要同时加入核酸酶抑制剂
二、实验方法及一般步骤
2）破碎抽提核酸除去杂质
➢ 首先使脱氧核糖核蛋白、核糖体、病毒的核蛋白与其它 成分分离
➢ 使核酸与蛋白质分离 ➢ 除去脂类 ➢ 多糖的除去
二、实验方法及一般步骤
3）核酸的纯化
根据所需核酸的性质和特点除去其它核酸污染, 并除去提取过程中的系列试剂(盐、有机溶剂等） 杂质，最后得到均一的核酸样品。
❖ 提取DNA主要是对基因和基因组进行分析。 ❖提取RNA主要是为了对基因表达实验方法及一般步骤
目前从样品中分离DNA的方法主要有两种， 分为CTAB法和SDS法（表面活性剂，能溶解细 胞膜和核膜蛋白，是核蛋白解聚，从而使DNA得 以游离出来）。
RNA（核糖核酸）
存在于细胞质中，如mRNA, rRNA, tRNA等。
除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病毒和噬菌 体，其或只含DNA，或只含有RNA。
一.实验原理及目的
❖ 2、真核生物的一切有核细胞（包括培养细胞）都能用来 制备基因组DNA。真核生物的DNA是以染色体的形式存在 于细胞核内，因此，制备DNA的原则是既要将DNA与蛋白 质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。提取 DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含SDS（十二烷 基硫酸钠）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚 和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇 沉淀使DNA从溶液中析出。
三. 注意事项——材料准备
➢ 最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要 反复冻融
➢ 提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞 （白细胞）
➢ 细胞培养时间不能过长，否则会造成DNA降 解
➢ 含病毒的液体材料DNA含量较少，提取前先 富集
3. 注意事项——细胞裂解
➢ 材料应适量，过多和过少会造成裂解不彻底， 导致DNA量少，纯度低。
➢ 针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：
• 植物材料－－液氮研磨 • 动物组织－－匀浆或液氮研磨 • 组培细胞－－蛋白酶K • 细菌－－溶菌酶破壁
➢ 高温温浴时，定时轻柔振荡
三. 注意事项——核酸分离、纯化
➢ 采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提 供相应的缓冲体系
➢ 采用有机溶剂（酚/氯仿）抽提时应充分混匀， 但动作要轻柔
二、实验方法及一般步骤
核酸制备中常用的去垢剂
核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。用于核酸 提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂。 去垢剂的作用： 1．溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂； 2．溶解核糖体上面的蛋白质，使其解聚，将核酸释放出 来； 3．对RNase、DNase有一定的抑制作用。
如：SDS、脱氧胆酸钠、4-氨基水杨酸钠、萘-1.5-二磺酸钠、 三异丙基萘磺酸钠
① 重新纯化DNA，去 除蛋白、多糖、多酚 等杂质
② 重新沉淀DNA，让 酒精充分挥发
③ 增加70％乙醇洗涤 的次数（2-3次）
五、 DNA提取常见问题
问题二：DNA降解
原
因
① 材料不新鲜或反复冻
融
② 未很好抑制内源核酸 对
酶的活性 ③ 提取过程操作过于剧
策
烈，DNA被机械打断
④ 外源核酸酶污染
⑤ DNA样品反复冻融
二、实验方法及一般步骤
核酸制备中常用的蛋白质变性剂
作用： 1.使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造
成蛋白污染。
2.使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸。
3.某些蛋白质变性剂也有抑制 RNase活性和破裂细胞的作用。 如：苯酚、氯仿、盐酸胍、DEPC
二、实验方法及一般步骤
核酸制备中常用的酶 DNase:降解DNA RNase：降解RNA 蛋白酶K：降解蛋白质