解密根际微生物对细菌性疾病的抑制

解密根际微生物对细菌性疾病的抑制

与其他真核细胞生物一样，植物及其与之相关微生物可被看作是一个整体，它们相互依赖，，特别是土壤微生物对植物均具有特殊的功能和特点。植物能通过使一些有益菌群在根际定值，影响他们的活动与多样性。数十年来，关于微生物与植物相互作用的研究均关注在病原体,共生的根瘤菌和菌根真菌这几个方面，还未有证据证实其他土壤的微生物能影响植物的生长和健康。植物根部的活动能补充有益土壤菌群来对抗病原体的攻击，但这些机制尚未被证实。因此，本实验的目的在于解释根际微生物怎样去识别病原微生物，解开其保护植物的机制。

我们使用了高精度的16S核糖体DNA微阵列鉴定在抑制疾病土壤中生长的重要的植物根际细菌与古菌菌落成员。我们随后把特殊的细菌分类单元分离出来作为目标，阐明潜在的病原体控制的生物合成途径的基因和路径。

我们研究的土壤能抑制水稻纹枯病菌，能造成许多农作物包括甜菜、马铃薯、大米等病害的真菌病原体。这个土壤于2004年在荷兰甜菜研究所进行了实地调查。在土壤被发现之前，种植甜菜的田由于水稻纹枯病菌受灾严重。我们在温室条件下进行试验，以甜菜作为寄主植物，土壤保持着它特殊的抑制水稻纹枯病菌的活性（表S1）。在两种土壤种植甜菜时，没有真菌病原体生长情况一致。

使用巴氏消毒后大多数抑制病害的土壤会失去抑制病害的活性。当抑制立枯丝核菌的土壤在50℃加热时，抑制能力减弱了，当在80摄氏度加热后，发病率变得和患病土壤一样高(Fig. 1B and fig. S1)。使用伽马辐射土壤以后也会使土壤失去抑制病害的能力。土壤转移实验步骤为：在种植甜菜前，使用少量的抑制病害土壤(1 to 10% 的质量百分比)与患病型土壤混匀，结果显示抑制病害土壤与患病型土壤在比例为1比9时，甜菜患病率已经明显降低了(Fig. 1 and fig. S1).。这些结果表明抑制病害的活性物质为自然中的微生物。

根据甜菜土壤根际微生物不同抑制病害水平将宏基因组DNA分为不同的等级，即抑制病害土壤，患病土壤，10%质量抑病土壤与患病土壤混合，抑病土壤在50℃加热，抑病土壤在80℃加热，使用水稻纹枯病菌接种在患病土壤中检测哪些细菌对病原体真菌的存在具有反应。(fig. S3).

在根际微生物中一共检测到了33,346个细菌和古细菌操作分类单元(Fig. 2A)，比其他

研究的数据丰富。主要细菌门的总体分布为Chloroflexi（绿弯菌门）1%,蓝藻细菌门Cyanobacteria20%，厚壁菌门Firmicutes 和变形菌门Proteobacteria分别为39%，未分类的细菌门16%(fig. S4).。

当比较六种土壤处理时，细菌操作分类单元未发现有显著的区别(Fig. 2A)，然而，当把检测到的分类单元丰度考虑进来的时候，我们发现6个样品的聚合与六种处理相符合。(Fig. 2B and fig. S5).这些结果表明几种细菌分类群的相对丰富度是更重要的指标相对于特殊菌群的存在来说。

变形菌门（Pseudomonadaceae, Burkholderiaceae, Xanthomonadales）和厚壁菌门(Lactobacillaceae)被鉴定为与抑制病害关联最多的动态分类群：相比患病土壤这些菌在抑病土壤中更丰富；相比患病土壤在转化土壤中更丰富；相比患病土壤，相比接种病原菌土壤，在抑制土壤更丰富(Fig. 3 and tableS3)。单独的聚类分析能确认他们与抑制病害土壤之间的关系(fig. S6)。相比患病土壤，放线菌在抑病土壤中也更丰富，是抑病土壤中与真菌病原体相关的具有最高活力的类群(Fig. 3)。基于培养方式鉴定抑病土壤中具有特殊功能的类群可使用遗传与基因分析。例如，假单胞菌科细菌已经被发现对自然环境中一些真菌病原体具有抑制作用。显而易见地是，我们使用免培养进行PhyloChip分析，指出变形菌门，特别是假单胞杆菌科在抑制病原真菌中具有重要作用，因此随后我们把工作的重点放在了研究假单胞杆菌中。

在种植甜菜后任意挑选抑病土壤或患病土壤根际悬浮液进行培养，纯化后，检测对病原真菌的活性（table S4）。从培养基中获取了大部分抑病土壤中分离的拮抗菌，使用DNA指纹识别将其分为10个单元型（SH-A to SH-J），16S rDNA测序确定这些类群属于假单胞杆菌(Fig. 4A)。使用16S rDNA在PhyloChip数据库中比对，证实这些单元型与具有活力的假单胞杆菌高度相似(94 to 98% identity) (table S3)，在抑病土壤中相对丰富度更高相比患病土壤中(Fig. 4B).。

SH-A（38），SH-B（21），SH-C（37）占了从抑病土壤中分离到的菌株的90%，被用作下一步的研究。使用这三类群中的每一个菌株对植物进行验证实验说明只有菌株SH-C52保护植物种子不被病原菌侵染(fig. S7)。随机转座诱变产生的两个菌株SH-C52的突变体对病原体没有活性，且与syrE具有69%序列相似性，可能为丁香假单胞菌的syr-syp基因生物合成路径。非核糖体合成酶突变体O33没有像与其亲本的SH-C52一样保护植物种子被病原菌侵染(fig. S7)。后来的遗传分析显示，其生物合成路径由两种基因群构成，分别为thaAB 和thaC1C2D，被预测为编码九氨基氯化脂肽(fig. S8)。

本研究采用多方位的方法，将纯培养与免培养联系在一起，显示植物和哺乳动物与昆虫一样，依赖特定的由微生物群落产生的特定化学成分保护植物不被病原体侵染。展示了变形菌门特别是假单胞菌科通过由基因NRPS分泌氯化脂肽来保护植物不被病原菌感染。更深层次的分析揭示了植物与植物患病有关的单倍体SH-A和SH-C的表达显著差异(fig. S7)，表明在原产地抗真菌活性被一些特定的细菌群落所控制。与假单胞菌类似的是，一些其他的细菌群落在本研究中被发现与抑制病原体有关(Fig. 3)。包括伯克氏菌科，黄色单胞菌目，放线菌对病原真菌包括水稻纹枯病有抑制作用。这些发现表明土壤的抑病能力这一复杂现象不仅仅是由于单一的菌群造成的，更可能是由菌群联合在一起共同控制的。Koch’s等通过观察鉴定发现土壤中那些通过单独检测没有抑制病原菌活性的菌株，能协同抑病菌一起抑制病原菌。本实验细菌和生物合成路径鉴定为阐明植物是否能通过补充土壤微生物群有益菌来保护植物，以及怎样补充土壤微生物群有益菌提供了一套微生物基因标记。

材料和方法

土壤样品收集和储存

抑病土壤于2004年底在荷兰靠近胡芬镇(51º35’10”N4º34”44’E)甜菜种植地收集。收集了25个随机点，土壤深度为0-30 cm。患病土壤从甜菜地边缘收集，土壤不适合耕种甜菜，土壤被野草覆盖。两种土壤晒干后，使用0.5cm的网筛除植物碎屑，常温放置于桶中。在BLGG-AgroXpertus进行土壤的物理化学分析。

抑病土壤的生物测定与评价

甜菜种子播种在含有250g土壤PVC盆中（宽6 cm; 高8 cm），土壤初始水分含量为10%。随后将盆置于室内，管理条件为24℃，相对湿度70%，16小时光照，每周使用荷格伦特标准溶液浇水。土壤可分为抑病土壤；患病土壤；患病土壤与抑病土壤比例9:1；抑病土壤分别在50℃，在80℃加热1小时，以及伽玛辐射抑病土壤这几类，对于每份土壤的处理进行了四个重复，最后随机选取一个进行实验。种子发芽四天后，将种子减少至每盆8个。真菌病原体立枯丝核菌使PDA培养基培养1周后接种于每个盆相对的角，土壤表面底部1cm 的土壤中。每隔两三天计数一次被感染的甜菜苗数量直到二十天以后。