神经系统遗传病的基因诊断

传统的诊断（举例）：
１、问、望、听、触经验型诊断 ２、化验/检验—材料：细胞、组织、大分子、小分 子、代谢/排泄物等。方法：细胞学、微生物学、生 物化学、免疫学、病理学等。 ３、影像学—X光、B超、CT、核磁共振、内窥镜等 。 ４、特殊检查—染色体检查、肌电/心电/脑电、骨密 度等。 在医学发展的过程中，这些方法发挥了巨大作 用，随着技术水平的发展，这些方法也在不断提高 和完善，也还会有其他新的诊断方法的问世。 这些诊断有一个无法逾越的鸿沟：预测 也就是说“发病”了才能诊断。
对照
实验
等位基因特异性PCR(Allele-Specific PCR, AS-PCR)
利用末端突变的引物进行PCR。 实际应用中，常使用三个引物： 5’ 5’ 正常上游引物 突变上游引物 A3’ G3’
3’
正常下游引物
5’
使用正常引物，在正常人有扩增，异常人无扩增。 使用突变引物，在异常人有扩增，正常人无扩增。 （严格条件下的PCR）
基因变异的类型
1、点突变— １）单个碱基置换 ２）单个碱基的缺失或插入 2、片段缺失—编码片段；调节序列 3、片段插入—编码片段；调节序列 4、重排—融合基因 5、扩增—拷贝大量增加 6、动态突变—遗传物质传递过程中不等交 换使STR重复数增加
原理：找突变
基础：PCR（聚合酶链反应）
DNA以指数形式扩增(2n)，其中长片段以线性形式扩增 (2n+2)，最终主产物片段长度在两个引物之间。
常用检查方法：DNA测序、芯片杂交等。
A C G T 位点1 位点2 位点3
芯片杂交结果示意图
常用技术
等位基因特异性寡核苷酸杂交（allelespecific oligonucleotide，ASO ）
当基因的突变部位和性质已完全明了时，可以 合成等位基因特异的寡核苷酸探针（allelespecific oligonucleotide，ASO）用同位素或非 同位素标记进行诊断。探针通常为长20bp左右的 核苷酸。用于探测点突变时需要合成两种或两种 以上的探针，一种与正常基因序列完全一致，能 与之稳定地杂交，但不能与突变基因序列杂交； 另一种与突变基因序列一致，能与突变基因序列 稳定杂交，但不能与正常基因序列稳定杂交，这 样，就可以把只有一个碱基发生了突变的基因区 别开来. PCR可结合ASO，即PCR－ASO技术，即先将 含有突变点的基因有关片段进行体外扩增，然后 再与ASO探针作点杂交，这样大大简化了方法， 节约了时间，而且只要极少量的基因组DNA就可
遗传病
大多数遗传病为先天性疾病，但先天性疾病
不一定是遗传病。 大多数遗传病表现出家族聚集性，但家族性 疾病不一定是遗传病。
遗传病诊断
1、病史、症状、体征


病史采集、外貌特征、发育状况。 2、系谱分析 单基因，多基因；显性，隐性；常染色体，性染色体。 表现度、外显率、隔代遗传。 遗传方式、发病风险。 3、染色体检查 标本—外周血、绒毛、羊水、活检组织。 分带—G-, R-, C-, [荧光原为杂交(FISH)] 分析—数目（单体、多体）、结构（易位、缺失、倒位‥) 指征—智力障碍、发育畸形、多发流产、不育等。 4、生化检查 主要用于分子病和先天性代谢缺陷。 5、基因诊断 直接诊断被检者的DNA或RNA。发展最快，前景最好。 直接DNA检测——缺失、突变、重排….。 间接遗传标记检测—多态性，连锁分析。 基因诊断技术：分子杂交、分子扩增、分子测序。
产生多态性的原因是内切酶位点的变化。 原位点的消失；新位点的产生。
GAATTC CTTAAG
I
1 1 2
GATTTC CTAAAG
II
2
7kb 5kb 3kb 2kb
2、第二代遗传标记—微卫星DNA(Microsatellite DNA) 属高度重复序列，重复单元2~6bp， 重复区大多几十~几百bp，分散在基因组 中，大多不存在于编码序列内，具有较高 的多态性。呈现孟德尔式遗传。目前微卫 星DNA已经发现了２万余个位点。 TTCAGCTAGCTCAGCAGCAGCAGCAGCAGAGCTTGC AAGTCGATCGAGTCGTCGTCGTCGTCGTCTCGAACG
稀有性(Human, 10-6)
可重复性(Hot site)
遗传病
由于遗传物质缺陷或发生改变而导致的机体
结构和功能的紊乱。
遗传病的危害
1、发病率逐年上升
2、住院儿童近1/3为遗传相关疾病 3、自然流产胚胎60%有染色体畸变
4、平均每人携带5~6个有害基因
5、人群中25%患有各类不同程度的遗传相关
碱基插入和缺失：由于碱基的增多或减少造成阅读
框架的改变—移码突变。 以上突变为稳定突变，即传递中不再变化的突变。 动态突变：传递中不断发生变化的突变，如三联体 核苷酸数目的变化，一般是由于不等交换所致。
突变的一般特性
可逆性 (Aa, aA)
多向性(Aa1, a2, a3, a4) 有害性
线粒体遗传病
线粒体基因组编码：
2个rRNA基因和22个tRNA基因
13种多肽基因： 核糖体蛋白基因rps4，rps13，rps14
细胞色素C氧化酶复合体基因coxI，coxII，coxIII ATP酶复合体基因atpA1，atpA2，atpA6，atpA9，atpA10 NADH脱氢酶复合体I基因：ND-1，DN-5
个体B 个体C
2、第三代遗传标记—单核苷酸多态性 (SNP) 某些DNA位点上，单个碱基存在着变化 。如：
SNP分布于整个基因组，可在基因内， 也可在基因间。估计每1000个bp存在一个。 在人类DNA序列变异中，SNP占90%。 单个碱基的插入和缺失不认为是SNP。 目前已知基因组中含有150万个SNP
遗传标记
1、第一代遗传标记—限制性酶切片段长度 多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP)
8kb
5kb
3kb
在个体和群体中，片段长度表现出多态性。 如3kb, 5kb, 7kb, 8kb… RFLP呈现孟德尔式遗传。 常用检查方法：核酸杂交；PCR-酶切等。
正常探针 GAG
点杂交
异常探针 TAG
点杂交
正常人 DNA
患者 DNA
正常人 DNA
患者 DNA
单链构象多态性PCR (SSCP-PCR)
DNA分子在电泳中的行为取决于分子量 和分子构象。 DNA单链的构象取决于序列。 PCR产物变形后于中性胶中电泳，与正常 对照比较，若电泳行为异常，则认为内含 突变的碱基。
常用检查方法：PCR等。
微卫星DNA PCR扩增结果（示例）：
500bp 400bp 300bp 240bp
该结果显示在所检查的人群中，该位点多 态性有4种。 微卫星DNA差异最小只相差2个碱基（重 复片段只有2个碱基）。
AATGGCGTAAGTCCGACCGTTCAGACTTGCCAGCT 个体A AATGGCCTAAGTCCGACCGTTCAGACTTGCCTGCT AATGGCATAAGTCCGACCGTTCAGACTTGCCGGCT
A
C
G
T
A T G G T A C C G C A T
染色体FISH探针 整条染色体涂染探针 染色体重复序列探针 染色体专一位点探针 基本过程： 1、染色体标本制备 2、探针制备 3、杂交 4、显微观察（染色体分带）
整条染色体涂染
通过整条染色体涂染判断易位染色体
引物原位标记技术(Primed in situ Labeling, PRINS)
循环数 总片段（单链） 长片段（单链） 短片段（单链）
０ ２ 2 0
１ ４ 4 0
２ ８ 6 2
３ 16 8 8
４ 32 10 22
５ 64 12 52
６ 128 14 114
７ 256 16 240
预变性(92-95C,2-5m)
PCR的一般过程：
变性(92-95C,30s)
(25-35)
复性
(40-60C,30s)
延伸
(72C,30-60s)
总延伸
(72C,7m)
经过30次的循环, 扩增的DNA片段可达100万倍以上。
策略1
直接诊断：直接检查致病基因本身的异常。它通常使用基因
本身或紧邻的DNA序列作为探针，或通过PCR扩增产物，以 探查基因无突变、缺失等异常及其性质，这称为直接基因诊 断，它适用已知基因异常的疾病； 间接诊断：当致病基因虽然已知但其异常尚属未知时，或致 病基因本身尚属未知时，也可以通过对受检者及其家系进行 连锁分析，以推断前者是否获得了带有致病基因的染色体。 连锁分析是基于紧密连锁的基因或遗传标记通常一起传给子 代，因而考察相邻DNA是否传递给了子代，可以间接地判断 致病基因是否传递给子代。连锁分析多使用基因组中广泛存 在的各种DNA多态性位，特别是基因突变部位或紧邻的多态 性位点作为标记。RFLP、VNTR、SSCP、AMP－FLP等技 术均可用于连锁分析。
21-三体又称先天愚型，Down综合征。 1866年英国医生JLH Down首先描述，1959年法国
Lejeune证实该病的病因是由于G组染色体多了一条，后确 定为21号。 发病率：1/600~1/800。 临床表现： １、特殊面容—眼距宽、鼻塌平、口半开、流口水、耳廓小 、手足短。 ２、发育不良、肌张力低、关节松弛、新生儿有第三囟门。 ３、部分患者有特殊肤纹，如通贯手、atd角达64(正常人 41)， ４、半数患者伴有先天性心脏病，白血病发病率高于正常20 倍。男性基本无生育能力，女性少数可有生育能力。大部分 寿命不长，少数可达50岁以上。
疾病 6、绝大多数遗传病目前没有理想的治疗方法
遗传病的分类
染色体病
单基因病 多基因病
线粒体基因病
染色体病
染色体病:染色体数目或结构异常。
常染色体病的共同特征：
智力低下、发育迟缓、多发畸形。
性染色体病的共同特征：
性征发育不全或畸形、智力较低。
21-三体综合征
单基因病
单基因病：染色体上单一基因的一个或两个
等位基因突变。
严格按照孟德尔规律遗传
临床上最多见。
多基因病
多基因病：一个或多个基因与一种或多种环
境因素共同作用产生的疾病。
没有严格的孟德尔传递规律。
病种少，但患病者多。
线粒体遗传病
线粒体遗传病是由于
mtDNA的突变所导致。 有性生殖的方式决定了 线粒体遗传属于母系遗 传。（细胞质遗传） 1987年首次提出线粒 体病概念，目前已经发 现100多种疾病与线粒 体DNA突变有关
基因诊断的对象
1、病原生物的侵入，如流感、肝炎、艾滋病
2、单基因遗传性疾病， 如苯丙酮尿症、无
丙种球蛋白血症 3、多基因疾病，如肿瘤、高血压 4、其它，如亲子鉴定、个体识别、法医物证
神经系统遗传病

Wilson’s disease (WD) Huntington’s disease (HD) Cadasil Melas (DMD) CMT SCA Leigh
基因诊断
Gene Diagnosis：detection of genetic disorders by

DNA analysis 直接在DNA或RNA水平上进行结构与功能检测，从而辅助临 床进行的诊断。 基因诊断是近年来临床医学中发展十分迅速的一类崭新的诊 断技术，它依托DNA重组技术，直接从基因型入手，诊断表 现型即可以越过产物（酶和蛋白质）直接检测基因结构而作 出诊断。（逆向诊断） 基因诊断始于1978年，Kan第一次成功进行了镰状细胞贫血 病的产前基因诊断。 基因诊断具有灵敏度高、特异性强、费用低，并对许多疾病 特别是遗传性疾病具有预测性的特点，是一种极具潜力的诊 断方法。
神经系统遗传病的基因诊断
杜万良 北京天坛医院神经内科 wldu@sohu.com
Fra Baidu bibliotek因
DNA上的功能单位。 基因结构模式图：
基因突变
DNA分子结构的化学变化。
突变的类型
碱基替换：某个碱基被另一个碱基所取代（点突
变）。嘌呤或嘧啶之间的取代为转换；嘌呤与嘧啶 之间的取代为颠换。
同义突变：突变后密码子改变但氨基酸不变化。 错义突变：突变后氨基酸发生改变。 无义突变：突变后变为终止密码。