10 第八章 亲和纯化

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• 2.6 螯合剂 • 如果亲和结合作用源于亲和分子对与 金属离子形成的配位键，则加入乙二 胺四乙酸(EDTA)等螯合剂除去金属离 子，可使亲和结合作用消失。
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3、亲和作用体系
• 酶反应的底物特异性即反映在一种酶仅与 特定的物质(底物)相结合并催化该物质发生 的特定反应。 • 此外，酶反应的可逆竞争性抑制剂和底物 一样与酶的活性部位结合，抑制酶的活性。 由于酶反应的产物来自底物，与底物具有 某种相似性，也往往成为酶反应的抑制剂。
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• 1.1静电作用
• 亲和作用分子对的结合部位上带有相反电荷时， 产生静电引力。
• 在中性pH下，蛋白质分子上的天冬氨酸、谷 氨酸和半胱氨酸等酸性氨基酸残基可带负电荷， 而精氨酸、赖氨酸和组氨酸等碱性氨基酸残基 可带正电荷。
• 此外N末端氨基酸的—氨基带正电荷，C末端氨 基酸的羧基带负电荷。
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• 1.2氢键
• 如果亲和作用分子对的一方分子中含有氧原子或 氮原子，结合部位之间可以产生氢键作用，即形 成O…H—O (0.26nm)或O…H—N (0.28～0.30nm)。
• 由于氧和氧或氧和氮原子与氢原子必须基本排列 在一条直线上，并且原子之间的距离达到一定程 度时才能产生氢键，因此氢键的产生与否受结合 部位之间位置关系的严格制约。
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• 2.1.6 三嗪类色素 • 三嗪类色素(triazinedyes)是一类分子内 含有三嗪环的合成活性染料，与各种需 要在NAD的存在下表现其生物活性的脱 氢酶和激酶具有结合作用。
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• 这类色素与NAD的结合部位相同，具有抑制 酶活性的作用，因此又称为生物模拟色素 (biomimeticdye)。 • 除脱氢酶和激酶外，三嗪类色素还与血清白 蛋白、干扰素、核酸酶和糖解酶等具有很高 的亲和结合能力，用途非常广泛。 • 利用色素为配基的亲和层析法又称色素亲和 层析(Dye—ligand affinity chromatography)。
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2、影响亲和作用的因素 2.1离子强度
• 如果亲和结合作用主要源于静电引力，则 提高离子强度无疑会减弱或完全破坏亲和 作用。 • 由于氢键的形成同样基于静电引力，因此 提高离子强度也会降低或消除氢键作用。
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• 与静电引力相反，疏水性相互作用随离 子强度提高而增大。因此，当亲和结合 作用主要源于疏水性相互作用时，增大 离子强度则可提高亲和结合作用。
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• 蛋白质分子表面的凹陷或凸起部位与 整个蛋白质分子相比要小得多，由于 不是整个分子或物质参与亲和结合， 亲和作用的分子(物质)对可以是：大 分子—小分子，大分子—大分子，大 分子—细胞，细胞—细胞。
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• 具有亲和作用的分子(物质)对之间具 有“钥匙”和“锁孔”的关系。 • 除此之外，还需要分子或原子水平的 各种相互作用才能完整地体现亲和结 合作用。这些相互作用包括以下几个 方面。
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• 2.1.7 过渡金属离子
• Cu2+，Ni2+，Zn2+和Co2+等过渡金属离子可 与N、S和O等供电原子(electron donor atom)产生配位键.
• 因此可与蛋白质表面的组氨酸(His)的咪唑 基、半胱氨酸(Cys)的巯基和色氨酸(Trp)的 吲哚基发生亲和结合作用，其中以His的咪 唑基的结合作用最强。
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• 过渡金属离子可通过与亚胺二乙酸 (iminodiacetic acid，IDA)或三羧甲基乙二胺 (tris(carboxymethyl)-ethylene diamine，TED) 形成螯合金属盐固定在固定相粒子表面，用做 亲和吸附蛋白质的配基。 • 这种利用金属离子为配基的亲和层析一般称为 金属螯合层析(Metal chelate chromatography) 或固定化金属离子亲和层析(Immobilized metal affinity chromatography，IMAC)。
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• 1.3 疏水性相互作用 • 如果亲和作用分子对的一方分子上含有芳 香环或烃基链等疏水基，另一方的结合部 位上也含有疏水区，则两者之间可发生疏 水性相互作用。
• 蛋白质的缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲 硫氨酸和脯氨酸等氨基酸残基含有碳氢链， 苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸残基含有芳香 环，这些氨基酸残基如暴露在结合部位， 则与另一分子的疏水基发生疏水性相互作 用。 12
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• 2.1.9 肝素 • 肝素(heparin)是存在于哺乳动物的肝、肺、 肠等脏器中的酸性多糖类物质，相对分子 质量一般为5至30kD，具有抗凝血作用。
• 肝素与脂蛋白、脂肪酶、甾体受体、限制性 核酸内切酶、抗凝血酶、凝血蛋白质等具有 亲和作用，可用作这些物质的亲和配基。 • 肝素的亲和结合作用在中性pH和低浓度盐溶 液中较强，随着盐浓度的增大结合作用降低。 38
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• 2.1亲和配基 • 2.1.1 酶的抑制剂 • 蛋白酶均存在抑制其活性的物质，这类物 质称为酶的抑制剂。 • 在生物体内蛋白酶的抑制剂可与蛋白酶的 活性部位结合，抑制酶的活性，必要时保 护生物组织不受蛋白酶的损害。 • 酶的抑制剂在分子大小和形态上分布较广， 有天然的生物大分子，也有小分子化合物。
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二、亲和层析
• 1、原理与操作 • 亲和层析是利用偶联亲和配基的亲和吸 附介质为固定相亲和吸附目标产物，使 目标产物得到分离纯化的液相层析法。
• 亲和层析操作与一般的固定床吸附操作 方式相同，多采用断通式前端分析法。
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• 2、亲和吸附介质 • 需根据目标产物选择适当的亲和配基 修饰固定相粒子，制备所需的亲和吸附 介质。
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• 反应机理为：
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• 2.2.2 环氧基活化法 • 可用于多糖凝胶和表面为氨基的载体的 活化，固定分子结构为R-NH2、R-OH 和R-SH的配基。
• 常用的活化试剂为1,4-丁二醇-二缩水甘 油醚(简称BGE)和环氧氯丙烷。
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• 活化过程需在强碱条件下进行，以活化羟基 为例，反应机理为：
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• 2.1.8 组氨酸
• 具有弱疏水性、咪唑环为弱电性,可与蛋白 质发生亲和结合作用。 • 在盐浓度较低和pH约等于目标蛋白质组氨 酸 白质等电点的溶液中，固定化组氨酸 的亲和吸附作用最强，随着盐浓度增大， 亲和吸附作用降低。
• 利用组氨酸为配基可亲和分离等电点相差 较大的蛋白质，洗脱则可采用增大盐浓度 的梯度洗脱法。
• 2.2 亲和吸附介质
• 将亲和配基的载体共价偶联在固体粒子的 表面（孔内）即可制备亲和吸附介质，该 固体粒子通常称为配基（carrier, support)。 因此，亲和吸附介质又称亲和载体 （affinity carrier, affinity support).
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• 作为载体的固体粒子应该满足以下要求：
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• 2.2 pH
• 蛋白质为多价两性电解质，含有许多解离 基团，不同解离基团的解离常数(pKa)不同。 • 如果静电引力对亲和结合作用的贡献较大， 则pH将严重影响亲和作用，即在适当的 pH下亲和结合作用较高，而在其他pH下 亲和结合作用减弱或完全消失。
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• 2.3 抑制氢键形成的物质
• 脲和盐酸胍(guanidinohydrochloricacid)的 存在可抑制氢键的形成。 • 因此，如果亲和结合作用中存在氢键，则 加入脲或盐酸胍可减弱亲和作用。 • 但是，脲和盐酸胍是蛋白质的强烈变性剂， 高浓度下容易引起蛋白质的失活或变性。
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• 2.1.4 凝集素
• 凝集素(lectin)是与糖特异性结合的蛋白质 (酶和抗体除外)的总称，大部分凝集素为多 聚体，含有两个以上的糖结合部位，不同 的凝集素与糖结合的特异性不同。
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• 2.1.5 辅酶和磷酸腺苷 • 各种脱氢酶和激酶需要在辅酶(coenzyme) 的存在下表现其生物催化活性，即脱氢 酶和激酶与辅酶之间具有亲和结合作用。
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• 生物分子间的这种特异性相互作用称为生 物亲和作用(bioaffinity)或简称亲和作用 (affinity)，通过亲和作用发生的结合称为特 异性结合(specific binding)或亲和结合 (affinity binding)。
• 利用生物分子间的这种特异性结合作用的 原理进行生物物质分离纯化的技术称为亲 和纯化技术(Affinity purification)，其代表 为亲和层析法(Affinity chromatography)。
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一、生物亲和作用
• 1、亲和作用的本质 • 亲和作用是自然界普遍存在的现象， 只是生物分子间的亲和作用具有更高 的选择性。一般如不特殊说明，亲和 作用均指生物分子间的特异性结合作 用。
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• 蛋白质的立体结构中含有某些参与亲和 结合的部位，这些结合部位呈凹陷或凸 起的结构，能与该蛋白质发生亲和作用 的分子恰好可以进入到此凹陷结构中， 或者该蛋白质的凸起部位恰好能够进入 与其发生亲和作用的分子(一般也是蛋 白质)的凹陷部位，就象钥匙和锁孔的 关系一样。
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• 2.1.2 抗体 • 利用抗体为配基的亲和层析又称免疫亲和层析 (Immunoafinity-chromatography)。 • 抗体与抗原之间具有高度特异性结合能力
• 利用免疫亲和层析法，特别是以单抗为配基的免 疫亲和层析法是高度纯化蛋白质类生物大分子的 有效手段。 • 单抗或者利用动物免疫实验从动物腹水中获得， 或者通过动物细胞培养获得，是一种昂贵的生物 活性物质，很难大规模使用。
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• 2.4 温度 • 由于温度升高使分子和原子的热运动加 剧，结合部位的静电作用弱。但温度上 升可使疏水性相互作用增强.
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• 2.5 离液离子 • 在SCN-，I-和CIO4-等离子半径较大的离 液阴离子存在下，疏水相互作用降低。 • 因此，如果疏水相互作用对亲和结合的 贡献较大，则添加这些离子会降低亲和 结合作用。
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• 2.1.3 A蛋白
• A蛋白(protein A)为相对分子质量约42kD 的蛋白质，存在于黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)的细胞壁中，占 该细胞壁构成成分的约5％。
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• 与动物免疫球蛋白G(immunogloblinG， IgG)具有很强的亲和结合作用. • A蛋白不与抗体(IgG)的抗原结合部位结合， 而且任何抗体的Fc片段的结构都非常相似， 因此A蛋白可作为各种抗体的亲和配基， 但不同抗体的结合常数有所不同。
• 1.4 配位键 • 如果亲和作用分子对均与同一金属原子配位， 则两者之间可通过金属配位键间接结合。
• 例如羧肽酶(carboxypeptidase)与其底物的 结合需要通过锌原子产生配位键。过渡金 属离子Cu2+，Zn2+和Ni2+等可与组氨酸的咪 唑基产生配位键，形成金属螯合结构。
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• 1.5弱共价键 • 弱共价键是指结合力较弱的可逆共价键， • 如氨基与甲酰基之间形成的Schiff碱(Schiff base)，醛基与羟基之间形成的半缩醛基 (hemiacetal)均为可逆共价键，结合力较弱。 当亲和作用分子对之间满足形成弱共价键 的条件时可能形成弱共价键。
生物分离技术（10）
微生物应用技术专业2009级 教室：2302
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第八章 亲和纯化
概念
利用生物分子间特异性结合的原理进行物质分 离纯化的技术称为亲和纯化技术(Affinity purification)，其代表性的方法为亲和层析法 (Affinity chromatography)。
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生物物质，具有识别特定物质并与该物 质的分子相结合的能力。这种识别并结 合的能力具有排他性，即生物分子能够 区分结构和性质非常相近的其他分子， 选择性地与其中某一种分子相结合。
• (1)具有亲水性多孔结构，无非特异性吸附， 比表面积大。 • (2)物理和化学稳定高，有较高的机械强度， 使用寿命长； • (3)含有可活化的反应基团 ,用于亲和配基的 固定化 • (4)粒径均一的球形粒子
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• 2.2.1 溴化腈活化法
• 用于多糖凝胶的活化，固定活性基团为氨 基的配基(R—NH2)。溴化腈(CNBr)对多糖 类载体的活化在碱性(pH>10)条件下数分钟 即可完成，之后的配基修饰亦需在碱性条 件进行，一般使用碳酸盐缓冲液。