小鼠原代kupffer细胞分离

1、小鼠肝脏Kupffer 细胞分离、纯化

参照Tetsuya Abe等的方法并加以改进。腹腔注射2%戊巴比妥钠

（40mg/kg），沿腹部正中做一约2cm 的切口，完全暴露门静脉，经门静脉置

入18G 套管针，置入位置约距离肝门1cm，插入约0.8cm，4-0 丝线固定后，

立即剪开下腔静脉，用无钙灌注液进行灌注，灌注速度约为10ml/min,同时剪

开上腔静脉，灌注过程见图 1.1、图1.2。灌注5min，共灌注无钙灌注液50ml/

只，灌注后肝脏体积膨大、颜色变浅，解剖剪分离取下肝脏，去除结缔组织及胆囊，在75%的酒精里漂洗5s，然后用PBS 漂洗三次，以防污染。放到盛

有PBS 的50ml 无菌瓶中，每批细胞需要灌注3-5 只小鼠。待所有小鼠肝脏

灌注好之后，一起放到细胞培养皿中，用眼科剪剪碎，加入0.1% 四型胶原

酶，每只约需5ml，放至37℃CO

2

培养箱，消化一小时，摇匀一次/15 min，

并用移液枪轻轻吹打1min。待组织块消化完全，细胞基本散落形成细胞悬液

后，过350 目滤网2 次，以去除未消化的组织块和结缔组织。

用15ml 离心管收集细胞悬液，300 rpm×3 min，离心两次，收集上清，

可以去除大部分的小鼠肝脏细胞。然后，1500 rpm×5 min，弃上清，收集沉

淀，用含有10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640 培养基悬浮细胞沉淀。

Percoll不连续密度梯度离心，2000g×20min，4℃；各层为上：细胞悬液2ml，中：25%Percoll 3ml，下：50%Percoll 3ml（用15ml 离心管，2-3 管/只）。先将50%

的Percoll液3ml 置于离心管底部，再沿着离心管管壁缓慢加入25%Percoll3ml

在50%Percoll 液上面，最后沿着管壁缓慢加入细胞悬液2ml 于最上层，见图

1.3 。离心后可见四层区带：最上一层为细胞碎片；第二层为富含肝窦内皮

细胞的区带；第三层为富含Kupffer 细胞的区带；第四层为积于管底的沉淀，

主要是红细胞，见图1.4 。将25%与50%Percoll 之间富含Kupffer 细胞的第

三层小心吸出，收集后PBS 漂洗两次以去除Percoll 液。将盛有漂洗过的细胞

沉淀的离心管插入到冰屑中，冰上作用40 min，以免影响细胞活力。Trypan

blue 染色检查，细胞活率达85%-90%。行细胞计数并调整细胞浓度为1×10

6

个/ml ，接种到24 孔板（每孔1ml 培养液）。10% RPMI 1640 混悬细胞后，

铺板贴壁，30 min，37℃。PBS 洗两次去除非贴壁细胞后，所得细胞即为小

鼠肝脏Kupffer 细胞，放至37℃CO

2

细胞培养箱继续培养。